1 связь полиморфизма генов gstm 1 и gstt 1 с уровнем цитогенетических нарушений у рабочих уранового производства icon

1 связь полиморфизма генов gstm 1 и gstt 1 с уровнем цитогенетических нарушений у рабочих уранового производства


Смотрите также:
Патогенетическое значение полиморфизма генов нейромедиаторной системы...
Автореферат диссертации на соискание ученой степени...
Десятая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей...
Исследование полиморфизма генов ариламин n-ацетилтрансфераз и ассоциации полиморфных вариантов с...
Лекция Макроэкономическое равновесие и его признаки. (4 ч)...
Экзаменационные вопросы по материаловедению Общая характеристика металлов. Металлическая связь...
На прошлой лекции было дано краткое введения в биоинформатику днк-биочип-экспериментов...
Программа утверждена на заседании Учёного совета физического факультета...
Задачи: Изучить нормативно-техническую документацию по регламентации пульсации освещенности...
Технология производства основные требования к рабочим чертежам...
Мотивационные факторы поведения молодых рабочих...
«Умственная отсталость»...



Загрузка...
скачать





Васильева З.Ж1., Берсимбаев Р.И.2, Бекманов Б.О.2, Воробцова И.Е.1


СВЯЗЬ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ GSTM1 и GSTT1 С УРОВНЕМ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ У РАБОЧИХ УРАНОВОГО ПРОИЗВОДСТВА


Исследована связь полиморфизмов генов GSTM1 и GSTT1 с уровнем хромосомных аберраций у рабочих Целинного горно-химического комбината, которые в результате профессиональной деятельности в течение 1-25 лет контактировали с производными урана. В исследованных группах рабочих наблюдалось достоверное, по сравнению с контролем (р<0,001), увеличение частоты хромосомных аберраций, в основном за счет – парных ацентрических фрагментов и одиночных фрагментов. Не выявлено взаимосвязи полиморфизма генов GSTM1 и GSTT1 с уровнем цитогенетических нарушений.


В процессе профессиональной деятельности человек подвергается воздействию различных антропогенных факторов, как химической, так и физической природы. Ключевая роль в метаболизме поступающих извне соединений принадлежит системе детоксикации ксенобиотиков. Вариации в активности ферментов детоксикации и индивидуальная чувствительность к воздействию токсических агентов обусловлена полиморфизмом генов, кодирующих ферменты биотрансформации ксенобиотиков. Установлено, что экспрессия полиморфных вариантов этого семейства генов непосредственно регулируется влияниями средовых факторов химической природы [1]. Полиморфизм генов GSTM1 и GSTT1 является одним из факторов, влияющих на частоту хромосомных аберраций при воздействии пестицидов, табачного дыма, ароматических углеводородов и т.д., при этом «нулевой» генотип GSTM1 обусловливает увеличение частоты аберраций хроматидного типа, а полная делеция по обоим генам: GSTM1 и GSTT1, ассоциируется с повышением частоты аберраций хромосомного типа [2]. Изучение влияния генных полиморфизмов на уровень хромосомных повреждений в когортах лиц, подвергающихся хроническому воздействию ионизирующего излучения может увеличить чувствительность цитогенетических показателей как биомаркеров генотоксического воздействия, а также помочь в идентификации групп риска. В связи с этим, целью настоящего исследования явилось изучение роли полиморфизма генов глутатион-S-трансферазы (GSTM1 и GSTT1) в индивидуальном цитогенетическом ответе на хроническое воздействие ионизирующей радиации.

Материалы и методы


Обследуемая группа состояла из 100 рабочих Целинного горно-химического комбината (ЦГХК) в г.Степногорск, Северного Казахстана, которые в процессе профессиональной деятельности контактировали с производными урана в течение 1-25 лет. В зависимости от профессионального стажа группа рабочих была разделена на 2 подгруппы: со стажем работы от 1 до 12,5 лет (50 человек); и со стажем работы – от 12,5 до 25 лет (50 человек). Контрольную группу составили 56 жителей Джамбулского района Алматинской области. Перед взятием биопроб крови, совместно с медицинскими работниками проводили анкетирование когорт, регистрируя: возраст, пол, профессиональный стаж, наличие заболеваний.

Никто из представителей контрольной группы не подвергался терапевтическому облучению, не имел профессионального контакта с химическими и радиоактивными веществами. Контрольная и экспонированная группа были выравнены по возрасту (+/- 5 лет); полу; национальности; в обеих группах не было зарегистрировано серьезных заболеваний.

Пробы крови забирали из локтевой вены в стерильные пробирки с гепарином для цитогенетического анализа и с ЭДТА - для молекулярно-генетического. Пробирки в специальном контейнере, при температуре +4-6ОС, транспортировали для анализа в диагностическую лабораторию в течение 10 час. Культивирование лимфоцитов проводили по стандартной методике [3]. К 200 мкл гепаринизированной крови добавляли 6,13 мл среды RPMI (Sigma-Aldrich Co., Irvine, UK), 0,61 мл сыворотки крупного рогатого скота (Sigma Chemical Co., St. Loius, USA), 0,06 мл пенициллина-стрептомицина (Sigma-Aldrich Co., Irvine, UK), 0,12 мл глутамина (Sigma-Aldrich Co., Irvine, UK Sigma-Aldrich Co., Irvine, UK) и 0,07 мл ФГА (Sigma-Aldrich Co., Irvine, UK) и инкубировали в термостате при 370С в течение 72 час. Колцемид в конечной концентрации 0,01мкг/мл (Gibco, New-York, USA) добавляли за 2 часа до снятия культуры. Через 72 часа культивирования клетки обрабатывали гипотоническим раствором 0,075 М КСL в течение 10 мин, трижды фиксировали в смеси метанол-ледяная уксусная кислота в объемном соотношении 3:1. Готовую суспензию клеток наносили на чистые охлажденные и влажные стекла. Высохшие мазки окрашивали 6% красителем Романовского-Гимза в течение 10 мин. Анализ хромосом производили с помощью светового микроскопа фирмы “Leica” (Germany), при суммарном увеличении х 1000.

Геномные мутации (анеуплоидия, полиплоидия) не учитывали, поскольку наиболее информативным показателем влияния мутагенов среды являются хромосомные аберрации. Пробелы (гэпы) в число аберраций не включали. Регистрировали все типы хромосомных аберраций, доступные для анализа при равномерном окрашивании хромосом (дицентрики, центрические кольца, парные и одиночные фрагменты). При микроскопическом исследовании метафазных пластинок придерживались критерия отбора и анализа препаратов, изложенных в работах Бочкова Н.П. и др. и Захарова А.Ф.и др.[3,4]. Всего было проанализировано 31200 метафазных пластинок. Для каждого человека анализировали по 200 метафаз. Хромосомный анализ проводили на зашифрованных препаратах методом “слепого контроля”.

Выделение ДНК из клеток крови проводили стандартным методом с фенол-хлороформной очисткой. Молекулярно-генетический анализ был проведен в США (Department of Preventive Medicine and Community Health, The University of Texas Medical Branch, Galveston). Генотипирование для генов GSTM1 и GSTT1 проводили с помощью мультиплексной ПЦР, используя соответствующие праймеры:

^ GSTM1: 5’-GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C

5’-GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G;

GSTT1: 5’-TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC

5’- TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA.

Электорофорез амплифицированных фрагментов ДНК проводили в 2%-ном агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Гомозиготность по «нулевым» аллелям генов GSTM1 и GSTT1 определяли по отсутствию специфических фрагментов размером 480 п.н. (для GSTT1) и 215 п.н. (для GSTM1).

Полученные результаты обрабатывали традиционными методами вариационной статистики [5]. Достоверность различий определяли, используя t - критерий Стьюдента, метод 2, дисперсионный анализ.


Результаты и обсуждение

^ Цитогенетическая характеристика обследованных групп

Результаты цитогенетического обследования групп представлены в таблице 1. Всего в экспонированной группе обнаружено 508 хромосомных аберраций, т.е. аберрации встречались с частотой 2,54±0,11%. Подавляющее большинство составляли парные ацентрические фрагменты – 387 (1,93±0,09%). Частота одиночных фрагментов составила 0,29±0,03%. Также были выявлены нестабильные хромосомные обмены (НХО) (0,31±0,04%), среди которых было 47 дицентриков и 16 центрических колец.

В первой и второй группах рабочих, имеющих профессиональный стаж от 1 до 12,5 лет и от 12,5 до 25 лет, соответственно, выявлено увеличение частоты хромосомных аберраций, в основном за счет парных ацентрических фрагментов. Уровень НХО в первой группе оказался выше, чем во второй. По-видимому, уменьшение количества НХО связано с длительным культивированием (72 часа), которое было предпринято с целью сохранения материала, вследствие длительной транспортировки крови. Выявлена тенденция к увеличению цитогенетических нарушений у рабочих, имевших более длительный профессиональный стаж. Обнаружены достоверные различия по частоте хромосомных аберраций между двумя экспонированными группами и контролем (р<0,001).

При обследовании контрольной группы среднегрупповая частота клеток с аберрациями составила 0,56±0,07%, из них доля НХО составляла 0,17±0,04%, парных фрагментов - 0,39±0,05%, одиночных фрагментов – 0,06±0,02%. Полученные нами результаты по частоте хромосомных аберраций в контрольной группе согласуются с аналогичными данными других исследователей [6-8]. Авторами было показано, что при обследовании 437 взрослых здоровых жителей г. Москвы, (проанализировано более 70 тысяч клеток), частота спонтанных хромосомных аберраций в культивированных лимфоцитах периферической крови человека составила 1,16%, при этом выявленные нарушения хроматидного типа, в основном одиночные фрагменты, составили более 50% всех аберраций [6]. Согласно данным Снигиревой с сотр., при цитогенетическом анализе 48124 метафаз от здоровых доноров доля НХО составила 0,02% [7]. В аналогичной работе других авторов, было обнаружено 36 НХО из 51893 проанализированных метафаз, что составило 0,07% [8]. Опираясь на эти результаты можно утверждать, что колебания частоты спонтанных аберраций хромосом у здоровых доноров, не подвергавшихся прямому радиационному воздействию, находятся в пределах 1-2%.

Известно, что в горнодобывающей промышленности, в частности, урановой, рабочие подвергаются хроническому влиянию ионизирующей радиации, в основном за счет радона и его дочерних короткоживущих продуктов [9]. Выявленное нами увеличение хромосомных нарушений у профессиональных рабочих подтверждается данными других исследователей, показавших, что у шахтеров уранодобывающих предприятий наблюдалось увеличение клеток с хромосомными аберрациями по сравнению с контролем [10,11,12]. Также показано, что увеличение числа аберрантных клеток по сравнению с контролем наблюдалось не только у лиц, занятых на переработке и добыче урана, но и у населения, проживающего вблизи уранодобывающих предприятий [13].

Таким образом, опираясь на наши собственные данные и результаты исследований других авторов можно заключить, что воздействие производственных факторов уранового производства на рабочих вызывает генотоксический эффект, выражающийся в увеличении частоты хромосомных аберраций. Цитогенетический анализ показал как увеличение частоты аберраций хромосомного типа – парных ацентрических фрагментов, дицентрических хромосом и центрических колец, являющихся известными маркерами радиационного воздействия, так и аберраций хроматидного типа – одиночных фрагментов, образование которых может быть вызвано комбинированным воздействием радиации и химических мутагенов.


^ Связь цитогенетических показателей с генотипом


Глутатион-S-трансферазы (GSTs) — полигенное суперсемейство изоферментов, включающее 7 семейств: α, μ, π1, σ, , κ, ξ [14]. Синтез глутатион-S-трансфераз контролируется различными генами, в которых выявлены полиморфизмы, приводящие к изменению активности фермента. Наибольший интерес представляют члены семейств μ и . Известно, что члены семейства μ (GSTM) - GSTM1, GSTM2, GSTM3, GSTM4, GSTM5, GSTM6, локализованы на хромосоме 1р13 [15]. Для гена GSTM1 установлены две мутации: точковая замена, не имеющая функциональных проявлений [16], и протяженная делеция гена (10 т.п.н.), которая приводит к полному отсутствию синтеза белкового продукта [17]. Член семейства  - ген GSTT1 локализован на хромосоме 22q11.2. Полиморфизм этого гена, обусловлен наличием двух аллелей — функционально активной (GSTT1*1) и неактивной (GSTT1*0) (нулевой). Аллель GSTT1*0 соответствует частичной или полной делеции, приводящей к снижению или отсутствию ферментативной активности [18].

Результаты генотипирования полиморфизма генов (GSTT1 и GSTM1) у рабочих Целинного горно-химического комбината и в контрольной группе представлены в таблице 2. Гены GSTT1 и GSTM1 анализировались на наличие или отсутствие делеции, т.е. «+/+» - нормальная аллель гена, наличие делеции по одному гену «+/-», «-/+»соответственно, «-/-» - полная делеция. Частоты гомозигот по делециям генов GSTT1 и GSTM1 среди рабочих составили 19% и 62%, соответственно. Полная делеция по двум генам GSTМ1 и GSTТ1 была выявлена у 8% рабочих. Полученные нами результаты по распространенности нулевого генотипа GSTT1 и GSTM1 согласуются с аналогичными литературными данными [4, 5].

В таблице 3 приведены результаты по связи полиморфизма генов GSTM1 и GSTT1 с цитогенетическими нарушениями (хромосомные аберрации) у обследованных лиц. Из полученных данных видно, что для отдельно взятых «плюсовых» и «минусовых» локусов генов GSTM1 и GSTT1, не было выявлено достоверно значимых различий по частоте хромосомных аберраций. Вместе с тем, у индивидуумов, как с делецией по отдельно взятым локусам этих генов, так и с полной делецией по двум генам GSTM1 и GSTT1, наблюдалась тенденция к увеличению частоты хромосомных аберраций, однако эти различия не достоверны. Результаты, полученные нами, согласуются с данными других авторов. В научном исследовании, проведенном совместно несколькими европейскими лабораториями (Италия, Норвегия, Дания, Финляндия), по взаимосвязи между частотой хромосомных аберраций, риском рака и генетическом полиморфизмом GSTM1 и GSTT1, не было установлено ассоциации между полиморфизмом генов (GSTM1 и GSTT1) и уровнем хромосомных аберраций, однако была выявлена зависимость между хромосомными нарушениями и риском рака [19]. В работе Сальниковой с соавторами также не выявлено взаимосвязи между частотой хромосомных аберраций с генотипами по отдельно взятым локусам (GSTM1, GSTT1, GSTP1 и MTHFR) у ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС [20].

Известно, что многие химические вещества, как эндогенные, так и поступающие из окружающей среды, обладают способностью усиливать синтез ферментов биотрансформации ксенобиотиков, что существенным образом определяет чувствительность организма к действию токсикантов. К числу сильных индукторов ферментов принадлежат и многие промышленные яды. Установлено, что индукция происходит за счет повторного попадания соединения в организм. Добыча и переработка урановой руды сопряжена с комбинированным воздействием на контингент профессиональных рабочих ряда потенциально вредных факторов: 1) радиоактивных элементов (урана, радия, тория и др.), входящих в виде аэрозолей в состав пылевой фракции воздуха; 2) радиоактивных газов радона и торона с дочерними продуктами распада; 3) внешнего - и -излучения урановой руды; 4) технологическим применением в урановом производстве активных реагентов с токсическими свойствами (паров кислот и щелочей) и присутствующих в руде химических соединений (пятиокиси фосфора, свободной двуокиси кремния, свинца, мышьяка и др.), многие из которых являются канцерогенами [9]. Таким образом, в результате хронического воздействия выше перечисленных соединений уранового производства происходит, по-видимому, постоянная индукция фермента глютатионтрансфераза, что приводит к истощению запаса глютатиона в клетках. Показано, что при поступлении токсикантов, в организме одновременно протекают процессы детоксикации и репарации. При однократном поступлении данных соединений в организм, интенсивность этих процессов может быть достаточной для компенсации ущерба, связанного с образованием реактивных метаболитов, однако при повторном воздействии, защитные механизмы могут оказаться несостоятельными, что приведет к развитию токсического процесса. Возможно, вследствие перечисленных выше причин, не обнаружено различия по частоте хромосомных аберраций между индивидуумами имеющими «плюсовой» и «минусовой» генотипы (таблица 3).


Авторы выражают глубокую признательность профессору У. Ау за предоставление результатов генотипического анализа, а также Амиргалиевой А. и Ибраимовой Ж. за помощь в культивировании лимфоцитов.

Научно-исследовательская работа проведена в рамках Международного гранта - «Мониторинг населения Северного Казахстана, проживающего вокруг урановых рудников» Грант CRDF КВ2-2289 (США).


^




Таблица 1. Частота хромосомных аберраций у рабочих Целинного

горно-химического комбината и в контрольной группе






Группа

Количество метафаз

(человек)

Количество

аберраций,

%

НХО

(дицентрики +

центр.кольца), %

Парные

фрагменты, %

Одиночные

фрагменты, %

I

10000(50)

2,410,15а-***

0,36 0,06

1,790,13 а-**

0,260,05 а-**




II

10000 (50)

2,670,16 а-***

0,270,06

2,080,14 а-**

0,320,05 а-**




Всего

20000 (100)

2,540,11 а-***

0,310,04

1,93 ± 0,09а-**

0,290,03 а-**

Контроль

11200 (56)

0,560,07

0,170,04

0,390,05

0,060,02


^ Примечание: а- отличие от контрольной группы,** - p< 0,01; *** - p< 0,001


Таблица 2. Частоты генотипов GSTM1 и GSTT1 у рабочих Целинного

горно-химического комбината и в контрольной группе



Генотип

Локус

Рабочие ЦГХК, %

Контроль, %

GSTМ1


+/+


38


59


-/-


62


41

GSTT1


+/+


81


73


-/-


19


27



^ Таблица 3. Распределение хромосомных аберраций в зависимости от генотипа (GSTM1 и GSTT1)

у рабочих Целинного горно-химического комбината и в контрольной группе




Локус

Генотип


I группа

(стаж 1-12,5 лет, n=50)


II группа

(стаж 12,5-25 лет, n=50)


Контроль

(n=56)


Количество

метафаз

(людей)


Количество

аберраций


Частота

аберраций


Количество

метафаз

(людей)


Количество

аберраций


Частота

аберраций


Количество

метафаз

(людей)


Количество

аберраций


Частота

аберраций



GSTM1


+


4200 (21)


88


2,10±0,22


3400 (17)


70


2,05±0,24


6600


36


0,54±0,08


-


5800 (29)


127


2,20±0,19


6600 (33)


163


2,47±0,19


4600


20


0,43±0,09


GSTT1


+


7800 (34)


157


2,01±0,16


8400 (42)


185


2,20±0,16


8200


44


0,53±0,07


-


2200 (11)


58


2,63±0,34


1600 (8)


48


3,00±0,43


3000


12


0,4±0,07



GSTM1 / GSTT1


-/ -


1000 (5)


32


3,20±0,56


600 (3)


22


3,60±0,77


1600


4


0,25±0,01


+/ -


1200 (6)


26



2,16±0,42


1000


26


2,60±0,50


1400


8


0,57±0,02


-/ +


4800 (24)


95


1,97±0,20


6000


141


2,35±0,19


3000


16


0,53±0,01


+ /+


3000 (15)


62


2.06±0,26


2400


44


1,83±0,27


5200


28


0,53±0,09


^ Таблица 4. Распределение хромосомных аберраций в зависимости

от генотипа (GSTM1 и GSTT1) по квартилям






Локус

Генотип


I квартиль



^ II квартиль


III квартиль


IV квартиль



N

(человек)


Частота

аберраций


N

(человек)


Частота

аберраций


N

(человек)


Частота

аберраций


N

(человек)


Частота

аберраций



GSTM1


+

21


4200

0.16±0.06

18


3600

0.80± 0.14

16


3200

1.65± 0.22

16


3200

3.28±0.31


-

18


3600

0.16± 0.06

21


4200

0.85± 0.14

23


4600

1.78± 0.19

23


4600

4.04±0.29


GSTT1


+

28


5600

0.14± 0.05

32


6400

0.84± 0.11

34


6800

1.72± 0.15


28


5600

3.69±0.25


-

11


2200

0.22± 0.09

7


1400

0.78 ±0.23

5


1000

1.80± 0.42

11


2200

3.81±0.40

GSTM1 / GSTT1


-/ -

5


1000

0.10± 0.09

5


1000

0.70± 0.26

1


200

2.5±1.10

5


1000

4.5±0.65


+ /+

15


3000

0.10 ±0.05

16


3200

0.78± 0.15

12


2400

1.60±0.25

10


2000

3.3±0.39



^ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Баранов В.С., Баранова Е.В., Иващенко Т.Э., Асеев М.В. Геном человека и гены «предрасположенности»; Введение в предиктивную медицину. СПб.:Интермедика, 2000.271 с.

  2. Scatpato R., Hirvonen A., Migliore L. et al // Mut.Res. 1997. 389. Р. 227-235.

  3. Бочков Н.П., Демин Ю.С., Лучник Н.В. // Генетика. 1972, Т. 8, № 5, С.133-141.

  4. Захаров А.Ф., Бенюш В.А., Кулешов Н.П., Барановская Л.И. Хромосомы человека: Атлас. Москва: Медицина. 1982. 264с.

  5. Рокицкий П.Ф. Введение в статистическую генетику. Минск: Вышейшая школа. 1978. 448с.

  6. Бочков Н. П., Чеботарев А. Н. Наследственность человека и мутагены внешней среды. Москва: Медицина.1989. 272с.

  7. CнигиреваГ.П., Новицкая Н.Н., Хазинс Е.Д., Вилкина Г.А.// Матер. Межд. конф. «Проблемы радиационной генетики на рубеже веков». Москва. 2000. С.331.

  8. Горбунова И.Н., Иванов К.Ю., Нагиба В.И. // Матер. Межд. конф. «Проблемы радиационной генетики на рубеже веков». Москва .2000.С.259.

  9. Андреева О.С., Бадьин В.И., Корнилов А.Н. Природный и обогащенный уран. Радиационно-гигиенические аспекты. Москва. Атомиздат. 1979. 212с.

  10. Берсимбаев Р.И., Шарипов И.К., Какабаев А.А. // Биотехнология. Теория и практика. 2000. № 3-4. С.18-21.

  11. Meszaros G., Bognar G., Koteles G.J. // Journal of occupational health.2004. V.46.P.310-315

  12. Smerhovsky Z, Landa K, Rössner P, Juzova D, Brabec M, Zudova Z, et al.// Mutat Res. 2002. 514. Р.165-176.

  13. Аu W.W., Lane R.G., Legator M.S., Whorton E.B., Wilkinson G.S., Gabehart G. J. // Environ. Health Persent.1995. № 5. Р.466-470

  14. Landi S. // Mutat. Res. 2000. 463. P. 247-283.

  15. Pearson W.R., Vorachek W.R., Xu S.J. et al. // Am.J.Human Genet.1993.53.P. 220-233.

  16. De Long J.L., Chang T.M., Whang-Peng J. et al. // Nucleic. Acid Res. 1988. V. 16. P.8541-8554.

  17. Seidegard J., Vorachek W.R., Pero R.W. et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1988.V. 85.P. 7293-7297.

  18. Pemble S., Schroeder K.R., Spencer S.R. et al. // Biochem J. 1994. V. 300. P. 271-276.

  19. Rossi A.M, Hansteen I-L., Skjelbred C.F., Ballardin M. et al. //Environ.Health.Perspect. 2009. February. 117. (2). P.203-208.

  20. Сальникова Л.Е., Фомин Д.К., Елисова Т.В., Акаева Э.А., Кузьмина Н.С., Лаптева Н.Ш., Нилова И.Н., Иофа Э.Л., Костина Л.Н., Кузнецова Г.И., Куликова Т.А., Панушкина О.Г., А.В. Рубанович. // Радиац. биология. Радиоэкология. 2008. Т.48 №3. С. 303-312.




Скачать 206,45 Kb.
оставить комментарий
Дата29.09.2011
Размер206,45 Kb.
ТипДокументы, Образовательные материалы
Добавить документ в свой блог или на сайт

отлично
  1
Ваша оценка:
Разместите кнопку на своём сайте или блоге:
rudocs.exdat.com

Загрузка...
База данных защищена авторским правом ©exdat 2000-2017
При копировании материала укажите ссылку
обратиться к администрации
Анализ
Справочники
Сценарии
Рефераты
Курсовые работы
Авторефераты
Программы
Методички
Документы
Понятия

опубликовать
Загрузка...
Документы

наверх