На прошлой лекции было дано краткое введения в биоинформатику днк-биочип-экспериментов. Теперь рассмотрим на конкретных примерах применение метода днк-биочипов icon

На прошлой лекции было дано краткое введения в биоинформатику днк-биочип-экспериментов. Теперь рассмотрим на конкретных примерах применение метода днк-биочипов



Смотрите также:
Сегодняшней лекции синтез днк, рнк и белков...
В. Ю. Попов Уральский государственный университет им. А. М. Горького 620083, г. Екатеринбург, пр...
Лекция тема: Использование днк-технологий в животноводстве...
Ошибки в структуре ДНК. Репарация...
Тема нуклеиновые кислоты...
Рассмотрим первый тип закраски...
Всероссийская олимпиада школьников по биологии...
Лекция Генетический код...
Нуклеиновые кислоты...
Е. М. Зуева, заведующая научно-методическим отделом Государственной научной педагогической...
Строение и жизнедеятельность бактерий...
Р. С. Гиляревский Знания информация данные...



скачать
Слайд 2.


На прошлой лекции было дано краткое введения в биоинформатику ДНК-биочип-экспериментов. Теперь рассмотрим на конкретных примерах применение метода ДНК-биочипов в биологии.

Самые распространенные области их применения – это анализ полиморфизма, анализ экспрессии генов и сравнительный анализ геномов.


Слайд 3.


Методы анализа с помощью ДНК-биочипов полиморфизма в геномной ДНК генов, особенно их регуляторных областей, позволяют не напрямую, но опосредованно исследовать изменения в транскриптоме, чему посвящена наша лекция, поэтому я вкратце опишу их.

Миллионы нуклеотидных позиций, вариабельных у разных особей (single nucleotide polymorphism – SNP), могут быть скринированы с помощью специально разработанных ДНК-биочипов. SNP-биочипы используются для исследования (1) сцепления между маркерами, (2) неравновесия по сцеплению (linkage disequilibria), (3) потери гетерозиготности (loss of heterozigosity).

На схеме представлены три экспериментальные стратегии для анализа последовательностей ДНК с помощью биочипов. Одноцветный анализ “gain-of-signal” позволяет после гибридизации с чипом, в котором для каждого SNP предусмотрены четыре различающихся по центральной вариабельной позиции аллель-специфичных олигонуклеотида, обнаруживать присутствие нового аллеля благодаря появлению нового сигнала. Двухцветный анализ “loss-of-signal” позволяет после конкурентной совместной гибридизации испытуемого и референсного образцов с SNP-биочипом с большей специфичностью обнаруживать присутствие нового аллеля. Наконец, метод минисеквенирования состоит в проведении реакции аллель-специфичного удлинения олигонуклеотида на один из четырех меченых дидезоксинуклеотидов прямо на чипе.


Слайд 4.


Рассмотрим теперь примеры анализа экспрессии генов с помощью ДНК-биочипов. Сформировалось целое направление – создание «молекулярных паспортов» каких-либо клеток или тканей, например, стволовых клеток. Пример взят из статьи: Tanaka T.S., et al., 2002. Gene expression profiling of embryo-derived stem cells reveals candidate genes associated with pluripotency and lineage specificity. Genome Res. 12(12):1921-1928 . Были взяты образцы четырёх клеточных линий: ES (эмбрионально-стволовые), TS3,.5 и TS6,.5 (трофобласт-стволовые), MEF (мышиные эмбриональные фибробласты), и мышиный кДНК-биочип NIA 15К. На графике гены, экспрессия которых достоверно (P < 0.05) превышала фоновое значение, выделены цветом. Кластер-анализ методом «k-средних» дифференциально экспрессирующихся генов выявил 15 кластеров, объединяющих гены со сходным профилем экспрессии.


Слайд 5.


На этом слайде показаны результаты иерархической кластеризации 346 генов, специфично экспрессирующихся в исследованных образцах. Видно, что кластеры A и E объединяют профили экспрессии генов, характерных для TS линии; кластер B – для MEF; кластер C – соответствует генам со слабой экспрессией; кластер D – для ES линии.

Каждому гену приписан номер принадлежности к какому-либо кластеру. Кластер 4 соответствует ES специфичным генам, 7 - TS специфичным, 14 - MEF- специфичным, 12 – общим для ES и TS клеток.


Слайд 6.


Кроме непосредственного измерения содержания транскриптов множества генов ДНК-биочип- технология позволяет исследовать зависимость транскрипции от таких фундаментальных процессов, как состояние хроматина множества генов, временем репликации этих генов, уровнем трансляции их транскриптов – и все это в масштабах всего генома.

Рассмотрим, как можно с помощью ДНК-биочипов исследовать связь между экспрессией генов и эпигенетическим состоянием геномных районов вокруг них, например, исследовать степень метилированности ДНК человека и млекопитающих.

Метилирование ДНК – один из эпигенетических механизмов. Основной мишенью для метилирования в геноме человека и млекопитающих является цитозин. Чаще всего метилирование происходит в контексте динуклеотидов CpG, хотя CpNG, CС(a/t)GG, CpA и CpT также могут быть метилированы. Так называемые «CpG-островки», как правило, охватывают промоторы и первые экзоны генов. Метилированое состояние «CpG-островков» часто ведет к подавлению экспрессии генов. Показано во многих работах, что распределение метилированных сайтов ДНК в нормальных и трансформированных клетках значительно различается – в опухолевых клетках наблюдается гипометилирование одних сайтов ДНК и гиперметилирование других.


Слайд 7.


На этом слайде показан принцип исследования связи между экспрессией генов и степенью метилированности их ДНК по материалам статьи Novik K.L., et al., 2002, Epigenomics: genome-wide study of methylation phenomena (Curr Issues Mol Biol. 4(4):111-128). Образцы из фрагментов геномной ДНК обрабатываются бисульфитом натрия, превращающего неметилированные цитозины в урацилы, затем эти образцы метятся в процессе амплификации и гибридизуются с олигонуклеотидными биочипами. Для каждого потенциального сайта метилирования разрабатывается пара олигонуклеотидов. В случае если сайт метилирован, то в анализируемой позиции образца останется цитозин, и сигнал после гибридизации будет от олигонуклеотида, содержащего в соответствующей позиции гуанозин (правая часть левого рисунка). А если сайт не метилирован, то сигнал будет от олигонуклеотида, содержащего в соответствующей позиции аденозин (левая часть левого рисунка). Если использовать двухцветную совместную гибридизацию испытываемого и референсного образцов, то анализ расположения зеленых, красных или желтых (т.е. образец представляет собой или гетерозиготу, или гетерогенную смесь клеток) сигналов на ДНК-биочипе позволит определить состояние метилированности каждого потенциального сайта метилирования ДНК каждого исследуемого гена. А сопоставление этих данных с результатами параллельного биочип-эксперимента по определению количества мРНК этих исследуемых генов в этих же образцах позволило выявить искомые корреляции между процессами метилирования ДНК генов и их уровнем транскрипции.

Слайд 8.



Рассмотрим, как можно исследовать связь между экспрессией генов и временем репликации соответствующих районов генома на примере статьи Schübeler D., et al., 2002, Genome-wide DNA replication profile for Drosophila melanogaster: a link between transcription and replication timing. Nature Genet. 32:438-442.

На рисунке показан профиль клеточного цикла, выявляемый после импульсного введения в клетки бром-дезокси-уридина (BrdU) и окрашивания клеток ДНК-специфическим красителем (пропидиум иодидом). Используя метод FACS (fluorescence-activated cell sorting), клетки затем сортируются по содержанию ДНК в зависимости от флуоресценции пропидиум иодида. Затем проводят иммунопреципитацию новосинтезированной ДНК антителами против BrdU, амплификацию осажденных фрагментов ДНК и введение в ампликоны флюорометки, в данном случае образцы из клеток, находящихся на стадии ранней репликации, помечены зеленым Су3, а образцы из клеток, находящихся на стадии поздней репликации, помечены красным Су5.

Совместная двухцветная гибридизация меченых образцов с кДНК-биочипом, содержащим 6500 генов дает возможность выявить момент репликации каждого конкретного гена. В этом эксперименте были использованы три биологические реплики, т.е. для приготовления образцов все процедуры и манипуляции с клетками и ДНК проводились независимо три раза.

Слайд 9.



После обработки данных гибридизации меченых образцов с кДНК-биочипом был получен репликационный профиль для 6500 генов из секвенированной части генома D. melanogaster. А сопоставление этих данных с результатами параллельного биочип-эксперимента по определению количества мРНК этих генов в этих же образцах позволило выявить корреляции между транскрипционной активностью гена и временем его репликации: чем выше уровень транскрипции гена, тем раньше он реплицируется, и наоборот.

Слайд 10.



Рассмотрим, как можно исследовать связь между транскрипционной и трансляционной активностями генов на материале статьи Arava Y., et al., 2003, Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae (Proc Natl Acad Sc USA. 100(7):3898-3894).

Эксперимент базируется на предположении, что чем больше уровень трансляции мРНК, тем больше на ней полисом. Поэтому сначала были экспериментально получены полисомные профили с помощью седиментации мРНК в сахарозном градиенте, отбора образцов из разных фракций, экстракция и обратная транскрипция образцов мРНК, мечение образцов кДНК. Затем проводилась гибридизация образцов кДНК с ДНК-биочипами, содержащими все открытые рамки считывания Saccharomyces cerevisiae

Слайд 11.



Таким образом получались количественные данные о содержании отдельных разновидностей мРНК в полисомальных фракциях. Экспрессия некоторых генов была проверена на полуколичественном уровне методом нозерн-блот-гибридизации.

Слайд 12.

Следует учитывать при таком подходе, что количество рибосом на мРНК зависит от длины транскрипта, поэтому необходимо исследовать не только число, но и плотность рибосом. На рисунках показаны: гистограмма А., на которой гены сгруппированы соответственно длине их ОРС, гистограмма В. Число генов как функция плотности рибосом и график С. Плотность рибосом как функция от длины ОРС.




Слайд 13.



В последнее время к таким компонентам транскриптома как мРНК, рибосомальным, транспортным, малым ядерным и т.д. РНК, был добавлен еще один – малые интерферирующие РНК, способные подавлять экспрессии генов через взаимодействие с их мРНК по механизму или расщепления транскриптов или подавлению трансляции с них. Среди этих новых представителей транскриптома особенно интересны микроРНК (или сокращенно – миРНК), поскольку они являются эндогенными продуктами генома, т.е. генерируются посредством транскрипции, и в этом отношении миРНК-гены сходны с белок-кодирующими генами тем, что обладают дифференциальной экспрессией. Поэтому получение данных о содержании конкретных миРНК на определенной стадии или в определенной ткани необходимо для полноценного и точного знания о механизмах, определяющих количество того или иного транскрипта, являющегося мишенью для какой-либо миРНК.

С этой целью разработаны методы профилирования экспрессии миРНК-генов с помощью специализированных ДНК-биочипов. На слайде приведена в качестве примера работа Barad et al., MicroRNA expression detected by oligonucleotide microarrays: system establishment and expression profiling in human tissues. (Genome Res. 2004 Dec;14(12):2486-94), в которой описан профиль экспрессии 150 миРНК человека в пяти органах и клеточной культуре. (Шкала интенсивности представляет log2 значений интенсивности сигнала после вычитания фона и нормализации).

Слайд 14.



На следующем слайде показаны пример работы по экспериментальной аннотация человеческого генома (Shoemaker DD, et al., Experimental annotation of the human genome using microarray technology. Nature. 2001 409:922-927).

В этой работе была предпринята попытка оценки компьютерных предсказаний генов и определение полноразмерных транскриптов с помощью выявления одновременной экспрессии их экзонов. Таким способом были проанализирована экспрессия генов из 22 хромосомы (8,183 экзонов) в 69 парах экспериментальных условий. Было выявлено 572 группы корегулируемых экзонов или 572 проверенных по экспрессии гена (expression-verified genes - EVGs). Это составило 210 (85%) из 247 известных генов 22 хромосомы и 185 (57%) из 325 предсказанных генов.

Слайд 15.



На этом слайде показаны псевдоцветное изображения взвешенного по ошибкам log10- отношения (красный/зеленый) экспрессии каждого из ~8000 экзонов. Можно видеть, как работает алгоритм выявления коэкспрессии экзонов и «сборка» их в ген.

Слайд 16.



Затем в этой же работе была проведена проверка полученных результатов с помощью ДНК-биочипов, содержащих 60-мерные фрагменты, перекрывающие геномные последовательности генов. С помощью этих перекрывающихся рядов проб, соответствующих обеим цепям отдельных геномных районов хромосомы 22, были уточнены границы экзонов и самих транскриптов.

Слайд 17.



В конце концов, в этой работе было проведено сканирование экзонов в масштабах всего генома: было взято 1 090 408 проб, 110 000 обратно-комплементарных проб, 50 биочипов, два экспериментальных условия (РНК из двух клеточных линий). На гистограммах показана в виде красных полос доля экспериментально (для этих условий) проверенных экзонов.

Слайд 18.



Теперь вкратце обрисуем круг области применения ДНК-биочиповых технологий исследования дифференциальной экспрессии генов в медицине.

При исследовании нормальных тканей можно составлять прогнозы, т.е. оценивать предрасположенности к тем или иным заболеваниям.

При исследовании пораженных болезнью тканей можно составлять/уточнять диагнозы, изучать течение и особенности патологии, выявлять мишени для лекарственных средств.

При исследовании тканей, подвергнутых воздействию химических соединений/лекарственных средств, получают информацию об эффективности лекарств, или о токсичности этих соединений.

Слайд 19.



Рассмотрим примеры работ по второму направлению, как наиболее представленному в литературе. Один из аспектов этого направления - молекулярная классификация злокачественных опухолей. Например, в статье Bittner M. et al., Molecular classification of cutaneous malignant melanoma by gene expression profiling (Nature. 2000, 406(6795):536-540) проведена селекция кластеров меланом с помощью двумерного кластерного анализа образцов опухолей и генов. В целях диагностики были выявлены четыре самых контрастных по экспрессии генов в кластерах и характеристические гены в них.

Слайд 20.



В приведенной работе проведена таксономия меланом на основе данных профилирования экспрессии генов с помощью кДНК-биочипа (6,971 генов). Показаны: a. Дендрограмма иерархической кластеризации 19 меланом по данным экспрессии генов; b. Трехмерный график значений MDS для 31 меланомы. Показан кластер из 19 образцов.

Слайд 21.



На этом слайде показано выявление генов, экспрессия которых позволяет различать кластеры меланом. Видны результаты MDS-анализа распределения генов по их вкладу в минимизацию объема кластера и максимизацию межкластерной дистанции; а также выделена экспрессия 22 самых заметных генов в кластерах.

Слайд 22.



В следующей статье, посвященной молекулярной классификации злокачественных опухолей, Khan J. et al., Classification and diagnostic prediction of cancers using gene expression profiling and artificial neural networks (Nat Med. 2001 7(6):673-679), описана таксономия нейробластом (NB), рабдомиосарком (RMS), лимфом Ходжкина (NHL) и опухолей семейства Эуинга (EWS) на основе данных профилирования экспрессии генов с помощью кДНК-биочипа, включающего последовательности 3789 кДНК и 2778 EST.


Слайд 23.


Недавно появился еще один метод массового исследования соотношения транскриптов в масштабах генома. Это метод «Массовое одновременное секвенирование характерных фрагментов»

Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS).

Этот метод позволяет идентифицировать почти все ДНК-фрагменты в образце. Он продуцирует количественный профиль экспрессии генов на основе подсчета всех мРНК в образце, и эти цифровые данные удобны для создания реляционных баз данных. Он обладает высокой чувствительностью, способностью детектировать редкие транскрипты. В каждый MPSS-анализ вовлечены более миллиона транскриптов, что обеспечивает исключительный динамический диапазон: от менее чем 10 транскриптов на миллион до 50,000 транскриптов на миллион.

Еще одно важное качество этого метода – для него не нужны предварительные молекулярно-генетические знания об организме.


Слайд 24.


Рассмотрим схему выполнения этой технологии по материалам статьи: Brenner S, Johnson M, Bridgham J, et al., Gene expression analysis by massively parallel signature sequencing (MPSS) on microbead arrays. Nat Biotechnol. 2000; 18(6):630-634..

Сначала готовят кДНК из мРНК и клонируют их в вектор, содержащий набор из 1.67 х 107 разных 32-мерных олигонуклеотидных меток. Пул кДНК матриц, представляющих 3-4 х 104 разных транскриптов, после клонирования формирует пул 5-7 х 1011 конъюгатов.

Далее берется образец, включающий только 1% (~1.6 х 105) от общего числа меток. Каждый транскрипт, таким образом, конъюгирован с уникальной меткой. Даже единичный транскрипт представлен с вероятностью более 99%.

Образец из конъюгатов амплифицируется в ПЦР, метки делают одноцепочечными. Конъюгаты гибридизуются с популяцией микрошариков, к которым присоединены все комплименты меток. 1% микрошариков будет связан с конъюгатами. Только эти будут отсортированы с помощью FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorter).


Слайд 25.


Определение последовательности на основе лигирования с помощью тип эндонуклеазы рестрикции второго типа BbvI. Смесь адаптеров, включающих все возможные четырехбуквенные выступы, отжигается к целевой последовательности так, чтобы лигировался только тот, который имеет совершенный комплементарный выступ. Каждый из этих 256 адаптеров имеет уникальный мотив, Fn, который может быть обнаружен после лигирования.

Например, на рисунке изображена последовательность выступа матрицы, взаимодействующая с адаптером, маркированным F126, что означает, что последовательность выступа матрицы "TTAC".

Следующий цикл начинается с расщепления BbvI, чтобы высвободить следующие четыре основания матрицы.

В составе кодирующих адаптеров предусмотрены декодирующие мотивы.


Слайд 26.


Использование кодирующих адаптеров, чтобы идентифицировать четыре основания в каждом цикле рестрикции-лигирования. После того как микрошарики, загруженные флуоресцентно помеченными (F) кДНК, изолированы с помощью FACS, кДНК разрезаются рестриктазой DpnII, чтобы высвободить четыре основами в виде выступа. Этот выступ достраивается до выступа с тремя основаниями.

Флуоресцентно помеченный (F) инициирующие адаптеры, содержащие ^ BbvI-сайты, лигируются к кДНК в отдельной реакции, после чего микрошарики загружаются в специальные ячейки.

Затем кДНК разрезаются BbvI, кодирующие адаптеры, прогибридизовавшиеся с ними, лигируются. Шестнадцать помеченных фикоэритрином (PE) зонда по отдельности гибридизуются с декодирующими мотивами кодирующих адаптеров. После каждой гибридизации ячейка сканируется, изображение рядов микрошариков анализируется для идентификации оснований выступов.

Кодирующие адаптеры снова обрабатываются BbvI, который расщепляет кДНК и высвобождает четыре новых основания для следующего цикла лигирования и расщепления.


Слайд 27.


На этом слайде показано, как выглядит проточная ячейка с микрошариками и как она используется.


Слева сверху – продольный разрез ячейки. Она сделана так, чтобы удерживать плоские ряды из микрошариков. Загрузка шариков и реагентов идет через входное отверстие. Шарики задерживаются специальным барьером, а растворы проходят насквозь. Небольшие перемещения шариков, зафиксированные сканером, учитываются при анализе изображений.


Слайд 28.


Здесь представлена общая схема устройства для проведения MPSS.

Проточная ячейка монтируется на терморегулируемом блоке Пельтье в конфокальном микроскопе, снабженном ксеноновой лампой, фильтрами и CCD-камерой.

Для сканирования изображения ряды микрошариков разделены на 18 секций с 62,000 шариков в каждой. Специальное программное обеспечение обрабатывает изображения, выделяя центр каждого микрошарика и суммируя флуоресцентный сигнал с определенных пикселов изображения.

Как правило, удается получить надежные данные о последовательности 16-20 нуклеотидов кДНК-матрицы. Далее начинается сказываться «шум» из-за ошибок рестрикции и лигирования.

Полученные 16-20-нуклеотидные мотивы потом преобразуются в сигнатуры с помощью специальных программ.


Слайд 29.


Так выглядит псевдоцветное компьютерное изображение некоторого количества микрошариков и изображения гистограмм значений флуоресцентного сигнала и расшифрованной последовательности некоего микрошарика.


Слайд 30.


В статье, впервые описывающей применение метода MPSS, приводятся также результаты сравнения данных о содержании транскриптов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, полученные этим методом и методом подсчета EST. Было просеквенировано 1,839 случайно выбранных кДНК-клона из библиотеки клеток THP-1.

MPSS-сигнатуры были соотнесены с EST-кластерами. На гистограмме приведены результаты обоих экспериментов: черные прямоугольники - MPSS-сигнатуры, а белые - EST-кластеры. Показаны проценты встречаемости сигнатур и кластеров от общего числа. 1% относительного содержания соответствует 2,500 сигнатурам и около 18 EST-последовательностям.


Слайд 31.


Теперь рассмотрим еще один очень важный и широко применяемый для измерения содержания транскриптов метод - ОТ-ПЦР с детекцией в реальном времени (real-time PCR).

Этот метод не относится к высокопродуктивным методам, однако его настоятельно рекомендуют использовать для подтверждения результатов вышеописанных масштабных и высокопродуктивных, но в сущности, скрининговых методов выявления кандидатов на дифференциально экспрессирующиеся гены.

Метод ОТ-ПЦР с детекцией в реальном времени обладает следующими чертами:

  • Позволяет следить за приращением количества специфического продукта в каждом цикле реакции;

  • Не требует выделения амплифицированных фрагментов кДНК;

  • Позволяет определять относительное и абсолютное количество последовательности-мишени;

  • Обладает высокой чувствительностью и расширенным динамическим диапазоном.


Слайд 32.


На этом слайде показаны некоторые наиболее часто упоминаемые приборы для проведения ОТ-ПЦР с детекцией в реальном времени:

  • iCycler фирмы BioRad;

  • LightCycler фирмы Roche;

  • FluorTracker фирмы Stratagene;

  • Семейство приборов фирмы Applied Biosystems/


Слайд 33.


Различают несколько типов ОТ-ПЦР с детекцией в реальном времени в зависимости от того, какие молекулы используются как источники флуоресценции. Ими могут быть:

  • интеркалирующие флуоресцентные красители – чаще всего SYBR Green 1;

  • флуоресцентные пробы/зонды – TaqMan, Molecular Beacons, LightCycler;

  • флуоресцентные затравки (primers) с элементом зонда – Scorpions.


Слайд 34.


Наиболее часто встречается ОТ-ПЦР с детекцией в реальном времени с применением TaqMan-проб. Рассмотрим эту методику.

TaqMan-проба представляет собой 25-30-мерный олигонуклеотид, соответствующий какому-либо участку кДНК-мишени. На 5’-конце его расположен нуклеотид, ковалентно связанный с репортерным флуорохромом, а на 3’-конце - нуклеотид, ковалентно связанный с молекулой, способной поглощать энергию возбуждения соседнего флуорохрома, иными словами – с гасителем. Пока оба флуорохрома связаны с олигонуклеотидом, сигнал от репортерного не детектируется. Этот эффект называется флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET - fluorescence resonance energy transfer).

В ПЦР участвуют еще два специфически связывающихся с кДНК-мишенью олигонуклеотида в качестве праймеров для реакции полимеризации. На стадии полимеризации после отжига всех трех олигонуклеотидов фермент Taq-полимераза, обладающий 5’-экзонуклеазной активностью, «натыкается» на TaqMan-пробу и начинает отщепляет ее нуклеотиды, начиная с первого, связанного с репортерным флуорохромом. Высвободившийся из физической близости с гасителем репортерный флуорохром тут же становится способным испускать сигнал. Поскольку в процессе реакции луч лазера периодически сканирует пробирку или лунку с реакцией, появление и приращение сигнала детектируется, и эта информация обрабатывается специальным программным обеспечением.

В результате работы последнего на экран выдается график величины сигнала репортерного флуорохрома как функция от номера цикла реакции. Мы видим типичную кинетическую кривую, отражающую процесс синтеза копий кДНК-мишени. Поскольку расщепление TaqMan-пробы происходит при синтезе только в одном направлении, то кинетика отражает арифметическую прогрессию, т.е. двукратное наращивание матрицы в каждом цикле. Через какое-время реакция выходит на плато, что означает истощение какого-либо компонента реакции.


Слайд 35.


При анализе данных ОТ-ПЦР с детекцией в реальном времени с применением TaqMan-проб используют следующие понятия:

  • базовая линия (baseline), линия на уровне средней величины фонового сигнала, детектируемого в течение первых 4-10 циклов;

  • пороговая линия (threshold), линия на уровне точки перехода кинетической кривой в рост от базовой линии или любая произвольная линия несколько выше базовой;

  • пороговый цикл (Ct), цикл пр котором произошел этот переход;

  • нормализованное значение сигнала (ΔRn), значение сигнала с вычтенным значение фона.


Слайд 36.


Н аэтом слайде показан принцип определения исходного количества кДНК-матрицы. Видно, что в реакцию добавляли десятикратные разбавления одной и той же матрицы, т.е. получали калибровочные кривые. Чем больше исходно было матрицы, тем на более раннем цикле наблюдали пороговый цикл (Ct).


Слайд 37.


Рассмотрим следующий тип проб для ОТ-ПЦР с детекцией в реальном времени – так называемые, «молекулярные маяки». Эти олигонуклеотиды организованы так, что область, комплементарная матрице-мишени, расположена в середине и окаймлена короткими инвертированными повторами, способными образовывать двухцепочечную стеблевую структуру. На 5’-конце этой конструкции так же, как и в TaqMan-пробе, расположен нуклеотид, ковалентно связанный с репортерным флуорохромом, а на 3’-конце - нуклеотид, ковалентно связанный с с гасителем, т.е. используется явление FRET. Для реакции также необходимы еще два последовательность-специфических праймера.

В процессе отжига праймеров олигонуклеотид-проба расправляется, и сигнал от репортерного детектируется на этой стадии. С каждым циклом количество матрицы-мишени удваивается, соответственно удваивается и сигнал репортерного флуорохрома.


Слайд 38.


Похоже действует проба LightCycler, состоящая из двух олигонуклеотидов, отжигающихся на матрице один рядом с другим с зазором не более 5-ти нуклеотидов. Также используются два флуорохрома и явление FRET. Однако в этом случае используется не флуорохром-гаситель, а флуорохром, преобразующий энергию, получаемую от флуорохрома-донора возбуждения. А флуорохром-реципиент становится репортером. Удвоение количества матрицы-мишени также детектируется на стадии отжига олигонуклеотидов и пробы.


Слайд 39.


Еще один тип проб для ОТ-ПЦР с детекцией в реальном времени – Scorpions – также основан на явлении FRET, в чем-то похож на молекулярный маяк. Однако имеется важное отличие от предыдущих типов проб-«скорпионы» объединяют в себе и пробу с флуорохромами, и праймеры для реакции синтеза копий матрицы—мишени.


Слайд 40.


На этом слайде показан принцип действия проб-«скорпионов».


Слайд 41.


Снова возвращаемся к нашей таблице, позволяющей наглядно сравнить характеристики методов детекции и оценки количества транскриптов по четырем основным параметрам.

По каждому из требований методу поставлена условная оценка близости к идеалу. Чем больше плюсов, тем метод лучше с точки зрения возможности производить цифровую информацию, пригодную для обработки методами биоинформатики.

Восклицательные знаки в строках для количественной ОТ-ПЦР и дифференциального дисплея означает предостережение по поводу нелинейных искажений, которые ПЦР-основанные методы могут вносить в исчисление соотношений между транскриптами.

Восклицательный знак в строке для EST-метода означает предостережение по поводу искажений в исчислении соотношений между транскриптами, вносимых модификациями приготовления библиотеки клонов кДНК.

Восклицательный знак в строке для олиго/кДНК-биочипов означает, что не всегда можно извлечь данные об абсолютном содержании транскриптов, что для это необходимы особые алгоритмические приемы при анализе данных.




Скачать 172,51 Kb.
оставить комментарий
Дата05.03.2012
Размер172,51 Kb.
ТипДокументы, Образовательные материалы
Добавить документ в свой блог или на сайт

Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Разместите кнопку на своём сайте или блоге:
rudocs.exdat.com

Загрузка...
База данных защищена авторским правом ©exdat 2000-2017
При копировании материала укажите ссылку
обратиться к администрации
Анализ
Справочники
Сценарии
Рефераты
Курсовые работы
Авторефераты
Программы
Методички
Документы
Понятия

опубликовать
Документы

наверх