Автореферат диссертации на соискание ученой степени icon

Автореферат диссертации на соискание ученой степени


Смотрите также:
Автореферат диссертации на соискание ученой степени...
Автореферат диссертации на соискание ученой степени...
Автореферат диссертации на соискание ученой степени...
Автореферат диссертации на соискание ученой степени...
Автореферат диссертации на соискание ученой степени...
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата педагогических наук. М., 2000...
Автореферат диссертации на соискание ученой степени...
Автореферат диссертации на соискание учёной степени...
Автореферат диссертации на соискание ученой степени...
Автореферат диссертации на соискание ученой степени...
Автореферат диссертации на соискание ученой степени...
Автореферат диссертации на соискание ученой степени...



Загрузка...
скачать


Н

а правах рукописи


Цыганков Александр Владимирович


тест-средства для определения алюминия, нитрита и пероксида водорода на основе целлюлозных носителей с ковалентно закрепленными хромогенными реагентами


02.00.02 - Аналитическая химия


Автореферат


диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук


Москва – 2010

Работа выполнена в лаборатории проблем аналитической химии Учреждения Российской академии наук Института общей и неорганической химии имени Н.С. Курнакова (ИОНХ РАН)



^ Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор

Островская Вера Михайловна







^ Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор

Иванов Вадим Михайлович





доктор химических наук, профессор

Кузнецов Владимир Витальевич







^ Ведущая организация:

Владимирский государственный университет



Защита состоится «22» декабря 2010 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д.002.021.01 при ИОНХ РАН по адресу: 119991 Москва, Ленинский пр., 31.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОНХ РАН. Автореферат см. на сайте www.igic-ras.ru.


Автореферат разослан «19» ноября 2010 года.



Ученый секретарь

диссертационного совета Д.002.021.01, Генералова Н. Б.

кандидат химических наук


Общая характеристика работы

Актуальность темы. Для оперативного химического анализа различных природных и технических объектов, особенно во внелабораторных условиях, требуются тест-средства, охватывающие, по возможности, все диапазоны концентраций определяемых компонентов. Для этого необходимо как адсорбционное (для больших концентраций аналита), так и ковалентное (для концентрирования на тест-средстве ультрамикроколичеств аналита) закрепление аналитического реагента на твердофазной матрице. Ковалентное закрепление индикатора дает возможность прочного, невымываемого закрепления продукта тест-реакции на тест-средстве, что улучшает воспроизводимость аналитического сигнала по сравнению с адсорбционным закреплением. Поэтому разработка тестов, основанных на использовании аналитических реагентов, ковалентно закрепленных на твердофазной матрице, является актуальной задачей.

При изготовлении тест-средств, таких как реагентные индикаторные бумаги (РИБ) с ковалентно иммобилизованными реагентами, ранее применялось закрепление аналитических реагентов на модифицированных целлюлозных матрицах, содержащих активные функциональные группы, такие как альдегидная или эпоксидная. Однако, ранее не применялись сами аналитические реагенты, содержащие, кроме функциональных аналитических групп (ФАГ), также химически активные группы, способные вступать в химическое взаимодействие с целлюлозной матрицей. Нами была поставлена задача ввести такие группы в реагент. Для таких аналитов, как алюминий, нитрит и пероксид этот подход представляет и теоретический, и практический интерес. В качестве активной группы эффективна эпоксидная группа, которая легко взаимодействует с протонодонорными реагентами.


Цель работы – создание высокочувствительных тест-методов определения алюминия, нитрита и пероксида водорода в широком диапазоне концентраций с использованием тест-средств с ковалентно закрепленными хромогенными реагентами.

В соответствии с целью были поставлены следующие основные задачи исследования:

  1. Проанализировать и обобщить литературные данные по реагентам на алюминий, нитрит, пероксид водорода.

  2. Проанализировать и обобщить литературные данные по реагентам и сорбентам с активными группами (в частности, эпоксидными).

  3. Разработать методы ковалентной иммобилизации аналитических реагентов – производных: алюминона (для алюминия); 3-гидрокси-7,8-бензо-1,2,3,4-тетрагидрохинолина (для нитрита); 1-(2-карбоксифенил)-5-(4-метил-6-метоксипиримидинил-2)-гидразидина (для пероксида водорода) на твердофазные носители.

  4. Разработать тест-методы определения: алюминия в природных объектах и на металлических поверхностях; нитрит-ионов в природных и питьевых водах; пероксида водорода в его технических препаратах.


Научная новизна работы. Разработаны три подхода к закреплению хромогенных аналитических реагентов на целлюлозном носителе:

  • совместное ковалентное и адсорбционное закрепление алюминона, приводящее при аналитической тест-реакции к смешанному комплексообразованию (алюминий образует комплекс и с закрепленной ковалентно, и с закрепленной адсорбционно молекулами алюминона);

  • ковалентное закрепление реагентов группы 3-гидрокси-7,8-бензо-1,2,3,4-тетрагидрохинолина на твердой матрице с протонодонорными группами, в результате чего ковалентно закрепленная азосоставляющая полностью вступает в реакцию с адсорбционно закрепленной подвижной диазосоставляющей с образованием невымываемого с носителя продукта аналитической тест-реакции;

  • многостадийный матричный синтез комплексов о-карбоксиарилгетерилгидразидинилцеллюлоз, вступающих в обратимые хромогенные окислительно-восстановительные тест-реакции.

Созданы тест-средства на алюминий, пригодные для определения алюминия до 0.005 мг/л в растворе, до 0.1 мкг/см2 на металлической поверхности. Установлено, что только применение смешанного (ковалентного и адсорбционного) закрепления алюминона на эпоксидированной целлюлозе позволяет добиться невымываемости продукта тест-реакции, что дает возможность определять алюминий на металлической поверхности, не загрязняя ее, а при определении алюминия в растворе – проводить концентрирование алюминия на индикаторной полосе; подобраны условия такого закрепления.

Созданы тест-средства на нитрит-ион, пригодные для определения нитрит-иона на уровне ПДК в питьевой воде (0.1 мг/л) с использованием устойчивого при хранении, не имеющего запаха, недерматозного и неканцерогенного реагента – 3-гидрокси-7,8-бензо-1,2,3,4-тетрагидрохинолина (ГБТГХ). Синтезированы новые производные этого реагента, и проведена их ковалентная иммобилизация на целлюлозную и кремнеземную матрицы. Достигнута нижняя граница определяемых концентраций 0.05 мг/л.

Создано новое тест-средство для определения пероксида водорода в фармацевтических и технологических препаратах (до 0.5 мг/л) с использованием медного комплекса 1-(2-карбоксифенил)-5-(4-метил-6-метоксипиримидинил-2)-формазанилцеллюлозы, причем это тест-средство дешевле и устойчивее, чем применявшиеся ранее ферментативные тест-средства.

С помощью ЯМР-, ИК- и электронной спектроскопии, масс-спектрометрии, РСА установлено строение продуктов тест-реакций.


Практическая значимость работы. На основе ковалентно закрепленных хромогенных аналитических реагентов разработаны новые высокочувствительные и селективные тест-средства определения алюминия, нитрита и пероксида водорода в природных и технологических объектах.

Созданы реагентные индикаторные бумажные тесты: РИБ-Алюминий-Тест с пределом обнаружения алюминия до 0.003 мг/л в растворе и полосы РИБ-Алюминий-Тест II с аккумулирующим жидкость слоем, способные определять до 0.1 мг/см2 на поверхности алюминиевых емкостей и резервуаров, не загрязняя ее. РИБ-Алюминий-Тест по чувствительности на 3 порядка превосходят индикаторные полоски фирмы Merck (Германия) – MERCKOQUANT ALUMINIUM-TEST.

Разработана методика синтеза реагента на нитрит-ион – ГБТГХ. С использованием ГБТГХ и его производных получены тест-средства, имеющие предел обнаружения в водах по нитриту на уровне ПДК и ниже (до 0.05 мг/л), которые применены для определения микроколичеств нитрит-ионов в природных водах и пищевых продуктах.

Разработан метод бесферментного определения пероксида с помощью тестовых полос на основе нового окислительно-восстановительного индикатора, устойчивого во времени и не требующего специальных условий хранения, пригодного для определения пероксида водорода до 25 мг/л. Индикаторное средство применено для контроля содержания пероксида в медицинских и косметических препаратах.


Положения, выносимые на защиту:

              1. Создание и апробация тест-средств для определения алюминия с использованием новой – смешанной (ковалентной и адсорбционной) иммобилизации алюминона на модифицированной целлюлозной матрице.

              2. Создание и апробация тест-средства для определения нитрита с использованием новых неканцерогенных и устойчивых реагентов, в том числе ковалентно закрепленных на целлюлозе и кремнеземе.

              3. Создание и апробация тест-средства на пероксид водорода с использованием нового бесферментного реагента – комплекса меди(I) с 1-(2-карбоксифенил)-5-(4-метил-6-метоксипиримидин-2-ил)-гидразидинилцеллюлозой.

              4. Данные о строении продуктов тест-реакций.


Личный вклад автора заключался в анализе литературных данных по теме диссертации; синтезе реагентов и изготовлении тест-средств, изучении характеристик тест-средств на модельных системах и реальных объектах; интерпретации и обработке результатов эксперимента.


Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на II Всероссийском симпозиуме «Тест-методы химического анализа» (Саратов, 2004), II Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2005), 7 международном конгрессе "Вода: экология и технология" ЭКВАТЭК-2006 (Москва, 2006), International Соngress on Analytical Sciences ICAS 2006 (Moscow, 2006), II Всероссийской конференции с международным участием «Аналитика России» (Краснодар, 2007), XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), 8 международном конгрессе «Вода: экология и технология» ЭКВАТЭК-2008 (Москва, 2008), XXIV Международной конференции по координационной химии и Молодежной конференции-школе «Физико-химические методы анализа в химии координационных соединений» (Санкт-Петербург, 2009), Съезде аналитиков России и школе молодых ученых «Аналитическая химия – новые методы и возможности (Москва, 2010).


Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей (из них 4 – в журналах, рекомендованных ВАК), 9 тезисов докладов на всероссийских и международных научных конференциях и получен 1 патент.


Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора (глава 1), экспериментальной части (глава 2), трех глав обсуждения результатов; выводов и списка литературы (191 наименование).

Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит 27 рисунков, 17 схем и 22 таблицы.


Основное содержание работы


Во введении обоснованы актуальность и цель работы, ее научная новизна и практическая значимость.


Глава 1. Тест-средства и тест-методы химического анализа (литературный обзор) содержит основные сведения о тест-средствах химического анализа, в частности, о тест-средствах с ковалентно закрепленными индикаторами. Приведены сведения о синтезе носителей и индикаторов с активной группой.


Глава 2. Объекты и методы исследования (экспериментальная часть) содержит рабочие методики синтеза и исследования полученных тест-средств. Для идентификации, изучения состава и строения новых соединений применялись методы тонкослойной хроматографии, элементного анализа, УФ-, ИК-, ЭПР- и ЯМР- спектроскопии, хромато-масс-спектрометрии, РСА. Изучение метрологических характеристик полученных экспресс-тестов производилось с помощью минирефлектометра и спектрофотометра.

Использовалось оборудование: рефлектометр «ЭКОТЕСТ-РТГ» фирмы «ЭКОНИКС» (РФ); ИК-спектрометр Specord M 80 (Германия); ЯМР-спектрометр Varian VXR-300 (300 МГц) (США); регистрирующий спектрофотометр TU-1800 (Тайвань); дифрактометр “Bruker AXS SMART 1000”, с CCD-детектором, и программное обеспечение к нему SMART (control) and SAINT (integration) software, Version 5.0, Bruker AXS Inc., Madison, WI, 1997 (США); иономер ЭКОТЕСТ (РФ); анализатор элементов СНNS ЕА 1108 (Carlo Erba, Италия); спектрофотометр КФК-3 (РФ); радиоспектрометр SE/X-2542 фирмы Radiopan рабочей частотой 9.45 ГГц (Польша); электронный микроскоп NT-MDT «Solver» (РФ); колориметр-рефлектометр МУЛЬТИЭКОТЕСТ фирмы «КОСТИП» КНЖГ 414212.001 ПС (РФ).

РСА проведен д.х.н., профессором С. Е. Нефедовым, спектры ЭПР сняты д.х.н. В. В. Мининым.


Глава 3. Тест-средство для определения алюминия. Для достижения высокой чувствительности мы применили алюминон как доступный и высокочувствительный реагент на алюминий. С целью повышения чувствительности и устойчивости тест-средства на основе алюминона мы решили осуществить ковалентное закрепление алюминона на хроматографической бумаге.

Алюминон при реакции с эпихлоргидрином (по данным масс-спектра) присоединял от 4 до 5 эпоксипропильных групп; продукт реакции с алюминием окрашивания не давал. Поэтому была предпринята попытка закрепления алюминона на модифицированную эпихлоргидрином хроматографическую бумагу. Оказалось, что при взаимодействии такой бумаги с алюминием окраска не развивается, что исключает образование комплекса состава 1:1, который ранее был определен В. Н. Тихоновым при рН 4.7 (Тихонов В. Н. Исследование механизма взаимодействия алюминия с алюминоном. // Известия высших учебных заведений. Химия и химическая технология. – 1977. – Т. 20, № 7. – С. 987–990.). Окрашивание развивалось либо тогда, когда на бумаге присутствовал незакрепленный алюминон, но в этом случае продукт реакции вымывался с носителя; либо тогда, когда на бумаге совместно присутствовали и ковалентно, и адсорбционно закрепленный алюминон, причем в этом случае продукт реакции не вымывался с носителя.

Когда при условиях проведения тест-реакции был выделен комплекс алюминия с алюминоном, то оказалось, что он имеет молярную массу 909.655 (по данным масс-спектрометрии m/z=909), что соответствует составу 2:2. Образование устойчивой невымываемой окраски только при смешанном закреплении говорит о том, что алюминий дает комплекс одновременно и с закрепленной ковалентно, и с закрепленной адсорбционно молекулами алюминона.

В качестве тест-средства была создана реагентная индикаторная бумага, состоящая из следующих компонентов: модифицированная эпихлоргидрином целлюлоза : адсорбированный алюминон : ковалентно иммобилизованный алюминон (500 ÷ 1000) : (5 ÷ 9) : 1. Об устойчивости к размыванию свидетельствует отсутствие окрашивания пробы и равномерность окраски индикаторной зоны РИБ.

При соотношениях адсорбированный алюминон : ковалентно закрепленный алюминон менее 5:1 окраска бумаги становится менее интенсивной, а при соотношениях более 9:1 бумага частично размывается и загрязняет исследуемый объект избытком реагента.

На устойчивость окраски влияет также время и температура закрепления нанесенного на модифицированную эпихлоргидрином целлюлозу водно-спиртового раствора алюминона.

Для бумаги-основы марки III (плотность 160 г/м2, тест-форма 3, РИБ-Алюминий-Тест II) оптимальной оказалась температура закрепления 100–105 С при концентрации пропиточного раствора 0.3% алюминона в водно-спиртовом растворе (об. 80:20), а для более тонкой бумаги-основы марки I (плотность 80 г/м2, тест-формы 1 и 2, РИБ-Алюминий-Тест) – 0.15% алюминона в таком же водно-спиртовом растворе, при температуре закрепления 95–100 С; время закрепления в обоих случаях (оптимальное) – 5 минут. Подбор условий закрепления для РИБ-Алюминий-Тест II представлен на рис. 1.



Рис. 1. Зависимость интенсивности окраски РИБ-Алюминий-Тест II после взаимодействия с раствором алюминия различных концентраций от концентрации пропиточного раствора и температуры закрепления алюминона. R=Rо/Ri – показатель интенсивности окраски; Rо и Ri – коэффициенты диффузного отражения чистой РИБ и продукта взаимодействия РИБ с алюминием(III) соответственно, измеренные при 565 нм.

Определение алюминия в растворах и на поверхности может быть осуществлено по цветовой шкале (рис. 2)


Концентрация Al

Рис. 2. Цветовая шкала для визуального определения алюминия(III) в водных растворах и на алюминиевой поверхности с помощью индикаторных полос (ИП)

1)

0

0.005

0.015

0.05

0.1

0.3

мг/л

2)

0

2

3

10

20

50

мг/л

3)

0

0.1

0.3

1

3

10

мкг/см2









1) Пропускание 20 мл раствора через зону Ø 6 мм

2) Погружение индикаторной полосы в раствор

3) Смачивание ИП каплей раствора на поверхности


Оценку правильности и воспроизводимости определения алюминия на металлической поверхности проводили методом введено-найдено (табл. 1) с использованием градуировочного графика, построенного на основе функции Кубелки-Мунка. В интервале концентраций 0-10 мкг/см2 при длине волны 565 нм величина F линейно зависит от концентрации алюминия и описывается уравнением F(c)=0.261c, R2=0.980.


Таблица 1. Результаты метрологической оценки определения алюминия на поверхности методом введено-найдено (Р = 0.95, n=3)

с, мкг/см2, введено





, мкг/см2, найдено

sr

1.50

0.437±0.005

0.367±0.012

1.39±0.05

0.03

0.80

0.52±0.02

0.22±0.02

0.833±0.076

0.09


Глава 4. Тест-средство для определения нитрита. Индикация нитрита затрудняется тем, что в процессе отбора пробы, консервации, транспортировки концентрация нитрита может меняться – как вследствие окисления его до нитрата, так и вследствие восстановления до нитрита присутствующего в растворе нитрата. Поэтому важно определять нитрит на месте отбора пробы.

В тест-средствах для определения нитрита мы применили реакцию Грисса, но выбрали не обычные реагенты (1-нафтиламин и его алкилпроизводные) – канцерогенные, дерматозные и неустойчивые — а 3-гидрокси-7,8-бензо-1,2,3,4-тетрагидрохинолин ^ (ГБТГХ, 4-1) и продукты его взаимодействия с эпихлоргидрином.

У этого реагента отсутствуют недостатки предшественников. Для молекулы 4-1 характерна практически плоская трициклическая структура с ограниченной возможностью вращения вокруг связи C—N, а также наличие гидроксигруппы, способной образовывать межмолекулярные водородные связи с гидроксигруппой. Это может быть гидроксигруппа целлюлозы, что позволяет иммобилизовать реагент 4-1 на целлюлозной матрице. Система сопряженных связей в молекуле 4-1 способствует глубокой окраске продуктов ее азосочетания с диазосоединениями. Реагент 4-1 и продукты его тест-реакций устойчивы на свету и при высокой температуре, и их можно долго хранить в таре или в иммобилизованном виде на бумаге.

Осуществлен синтез и установлены спектральные характеристики соединения ^ 4-1 и продуктов его реакции азосочетания с арилдиазосоединениями.

Модифицирован метод синтеза 4-1; обнаружено, что повышение температуры реакции при замене хлорбензола (т. кип. 131.68 °С) на более высококипящий 1,2-дихлорбензол (т. кип. 179.0 °С) приводит к увеличению выхода соединения 4-1 до 60%.

Мы попытались имитировать такие реакции с целью подбора оптимальных реагентов, в частности для исследования влияния природы заместителя в исходных ариламинах на величину батохромного сдвига.

Синтез 3-гидрокси-6-(R-арилазо)-7,8-бензо-1,2,3,4-тетрагидрохинолинов [R = 4-COOH (4-2), 2-COOH (4-3), 4-SO3H (4-4)] был проведен в две стадии: диазотированием ариламинов и азосочетанием образующихся диазосоединений с азосоставляющей 4-1 с выходом 65–75% (схема 1).


Схема 1



4-1 4-2–4-4

^ R = 4-COOH (4-2), R = 2-COOH (4-3), R = 4-SO3H (4-4)

В соединениях 4-1–4-4 интенсивные аналогичные по характеру полосы С–О при 1060 см-1 относятся к группировке С–ОН цикла. В ИК-спектре соединения 4-1 присутствуют интенсивные полосы поглощения групп ОН при 3424, NH при 3350, СНаром. 3045, СНалиф., (СН2) 2916 (s), 2820 (as), см-1.

В ИК-спектрах азосоединений ^ 4-4 обнаружены полосы этих же групп, но они значительно уширены, а в случае соединения 4-3 слиты в сплошную широкую интенсивную полосу в области 3400–2400 см-1, что, вероятно, обусловлено образованием водородных связей с участием растворителя (Me2CO, EtOH или воды, в зависимости от метода очистки). Наличие сольватных растворителей в кристаллических азосoединениях 4-2–4-4 подтверждается изменением растворимости (для 4-2), данными РСА (для 4-3) и данными изменения массы при нагревании в вакууме (для 4-4). В отличие от соединения 4-1 в ИК спектрах азосоединений 4-2–4-4 наблюдаются также полосы C–N при 1300–1200, N=N (транс) при 1550–1520, 1456, 960 см-1. В ИК-спектрах карбоксисоединений 4-2 и 4-3 присутствуют интенсивные полосы С=О при 1692 и 1664 см-1, соответственно, а в спектре сульфосоединения 4-4 имеются полосы S–О при 1028, 1004, 1000см-1, S=О при 1360, 1316, 1164см-1 и С–S при 664, 620 см-1.

Наличие в спектрах ЯМР 1Н соединений 4-1–4-4 (табл. 2) интенсивных сигналов в области 2.71–3.81 м.д., относимых к протонам при С(2), С(3), С(4) и сигнала в области 4.03–4.29 Н(ОН) подтверждает сохранение гидрированного кольца 3-гидроксихинолина в азопроизводных, причем электроноакцепторное влияние арилазогруппы на это кольцо в азосоединениях 4-24-4 по сравнению с соединением 4-1 (сдвиг сигналов в слабое поле в спектрах азосоединений) проявляется только для протонов при С(2), находящихся в положении 2 к аминогруппе, которая в свою очередь находится в положении 4 к арилазогруппе.


^ Таблица 2. Спектры ПМР соединений 4-14-4

Сое-дине-ние

δ, м.д.

2Н, С(4)

1Н, С(3)

2Н, С(2)

1Н, (ОН)

1Н, (NH)

1Н, С(6)

м, 5Н,

Н аром. гетероцикла

4Н, Н аром. фенилазогруппы

4-1

2.71, 2.78 (оба д)

3.04 (м)

3.27, 3.45 (оба д)

4.03 (с)

4.84 (с)

6.08 (д)

7.05–7.96



4-2

2.88, 2.93 (оба д)

3.14 (м)

3.59, 3.80 (оба д)

4.29 (с)

4.74 (уш. с)

-

7.63–7.68, 8.25–8.77

7.78 (д, 2Н, С(2'), С(6')); 8.05 (д, 2Н, С(3'), С(5'))

4-3

2.77, 2.84 (оба д)

3.29 (м)

3.61, 3.77 (оба д)

4.29 (с)

5.10 (с)

-

7.32–7.45, 7.86–8.85

7.49–7.83 (м)

4-4

2.74 – 3.81 алиф. м

4.29 (с)

-

-

7.32–7.74, 8.20,

8.77–8.80

7.80 (д, 2Н, С(2'), С(6')); 8.30 (д, 2Н, С(3'), С(5'))


В спектрах азосоединений 4-24-4 наблюдается значительный сдвиг сигналов протонов ароматических частей гетероцикла в слабое поле по сравнению с таковыми в соединении 4-1. Сигналы Н (NH) в cпектрах ЯМР Н1 свидетельствуют также о том, что если в соединении 4-3 (в молекуле которого 2-карбоксигруппа из-за ВВС не может взаимодействовать с аминогруппой) наблюдается интенсивный тонкий синглет протона аминогруппы при 5.10 м.д., в соединении 4-2 сигнал при 4.74 м.д. значительно уширен (вследствие взаимодействия аминогруппы с 4-карбоксигруппой), а в сульфокислоте 4-4 сигнал Н (NH) отсутствует, что свидетельствует о цвиттер-ионной структуре соединения 4-4.

Характер нуклеофильной активности соединения 4-1 наглядно определяется спектром ЯМР Н1. Сигнал протона при С(6) находится в сильном поле по сравнению с сигналами остальных ароматических протонов, что свидетельствует о наибольшей электронной плотности атома углерода в положении 6, в пара-положении к которому находится сильная электронодонорная NHAlk-группа. В соединениях 4-2–4-4 такой сигнал Н С(6) не обнаруживается. Сигналы всех остальных ароматических протонов сдвинуты в слабое поле на 1–2 единицы (табл. 4). Установлена возможность проведения азосочетания по атому углерода С(6). Остальные положения ароматической части соединения 4-1 к азосочетанию не активны.

Выделенные в индивидуальном виде азосоединения 4-24-4 имеют глубокие окраски и высокие молярные коэффициенты поглощения (рис. 3).



Рис. 3. ЭСП азосоединений:

4-2 (1), 4-3 (2), 4-4 (3).

ε – молярный коэффициент поглощения, л·моль-1·см-1.

рН 7.

Азосоединение ^ 4-3 имеет фиолетовую окраску, причем батохромный сдвиг максимума ЭСП по отношению к ЭСП изомера 4-2 составляет 50 нм. Можно было предполагать, что в азосоединении 4-3 карбоксигруппа, находящаяся в орто-положении к азогруппе, образует с ее атомом азота прочную ВВС, что и обусловливает батохромный сдвиг максимума спектра поглощения орто-изомера 4-3 по сравнению с пара-изомером 4-2.

Действительно, по данным РСА соединения 4-3 (рис. 4) атом водорода, выявленный из разностного ряда и уточненный изотропно, локализуется у атома азота N(2) на расстоянии 1.02Å (N(1)–N(2) 1.314(5)Å), расстояние О…Н при этом равно 1.63Å. Формальное депротонирование карбоксилатного фрагмента приводит к возникновению короткой межмолекулярной водородной связи 1.86Å с гидроксильной группой соседней молекулы 4-3 так, что образуется ассоциат двух молекул, координированных «голова к хвосту». Длины связей С–С арильного фрагмента выровнены и составляют 1.385(5)(6)–1.402(6)Å.



Рис. 4. Строение соединения 4-3 по данным РСА.

Таким образом, показана высокая нуклеофильная активность атома С(6) 3-гидрокси-7,8-бензо-1,2,3,4-тетрагидрохинолина в реакциях азосочетания с 4-диазобензойной, 2-диазобензойной кислотами и 4-диазобензолсульфокислотой с образованием глубокоокрашенных азокрасителей; на основе 4-1 и 4-аминобензойной и лимонной кислот был предложен РИБ-Нитрит-Тест, позволяющий определять нитрит в диапазоне 0.5–50 мг/л.

Ковалентную иммобилизацию 4-1 на модифицированной эпихлоргидрином целлюлозе осуществить не удалось. По-видимому, OH и NH группы тетрагидрохинолинового фрагмента стерически не доступны для химического взаимодействия с модифицированной целлюлозой, что подтверждается РСА соединения 4-3, содержащим этот фрагмент. Удалось осуществить ковалентную иммобилизацию его модифицированного эпихлоргидрином производного 4-5.

Было проведено взаимодействие 3-гидрокси-7,8-бензо-1,2,3,4-тетрагидрохинолина (ГБТГХ) с полуторакратным (молярным) избытком эпихлоргидрина. Из реакционной смеси выделены методом тонкослойной хроматографии три соединения: 4-5 с Rf1=0.62 – N-(2,3-эпоксипропил)-3-гидрокси-7,8-бензо-1,2,3,4-тетрагидрохинолин; 4-6 с Rf2.=0.44 – N-(3-хлор-2-гидроксипропил)-3-гидрокси-7,8-бензо-1,2,3,4-тетрагидрохинолин; 4-7 с Rf3=0.31 – 1,3-бис(3-гидрокси-7,8-бензо-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-1-ил)-2-(3,4-эпокси-1-оксабутил)-пропан (рис. 5).

Молярные массы установлены на основе анализа масс-спектров; были выявлены как исходные вещества, так и продукты их деструкции в условиях масс-спектрометрического эксперимента.

Реагенты 4-54-7 практически бесцветны, но в реакциях с диазосоединениями на пластинах Силуфол образуют красители, различающиеся по времени развития окраски и цвету.

Продукт 4-7 очень медленно вступает в реакцию азосочетания, что, по-видимому, обусловлено стерическими затруднениями.

Наиболее интересная цветная реакция азосочетания наблюдается у реагента 4-6 (табл. 3).










4-5

4-6

4-7

m/z 255

m/z 291

m/z 510

C16H17NO2

C16H18ClNO2

C32H34N2O4

м.м. 255.31

м.м. 291.77

М.м. 510.63


Рис. 5. Продукты реакции ГБТГХ с ЭХГ


^ Таблица 3. Реакции азосочетания разделенных ТСХ реагентов с 4-диазобензойной кислотой (ДБК) и 2-диазобензойной кислотой

Реагент

Rf

Реакция с ДБК

Реакция с диазотированной 2-аминобензойной кислотой

Цвет азокрасителей на пластине

Время развития окраски

Окрашивание фильтрата с СHCl3

Rf1=0.62

4-5

Красно-фиолетовый

5-30 с

Да

Нет

Rf2=0.44

4-6

Темно-фиолетовый

1-15 с

Да

Слабое окрашивание через 1 ч

Rf3=0.31

4-7

Фиолетовый неинтенсивный

30 с – 5 мин

Нет

Нет


Гистограммы коэффициентов отражения окрашенных азокрасителями силуфольных пластин сняты на минирефлектометре ЭКОТЕСТ (рис. 6).




Рис. 6. Гистограммы зависимости коэффициента R от максимума излучения светодиода для азосоединений, полученных на силуфоле после азосочетания соединений 4-5 и 4-6 с ДБК.

Таким образом, производные ГБТГХ (^ 4-1): N-(2,3-эпоксипропил)-3-гидрокси-7,8-бензо-1,2,3,4-тетрагидрохинолин (4-5), и N-(3-хлор-2-гидроксипропил)-3-гидрокси-7,8-бензо-1,2,3,4-тетрагидрохинолин (4-6) сохраняют активное к азосочетанию положение 6, содержат подвижные и стерически доступные для реакции замещения группы; реагент 4-6 вступает в химическую связь с силуфолом, реагент 4-5 – с целлюлозой (катализатор закрепления – уксусная кислота). Кроме того, преимуществом азосоставляющей 4-6 перед азосоставляющей 4-1 является более глубокое окрашивание образующегося азокрасителя при одной и той же диазосоставляющей (ДС).

На основе реагентов 4-1, 4-5, 4-6 предложены высокочувствительные тест-средства химического анализа разных форм для определения NO2-. на уровне ПДК (до 0.05 мг/л), в частности – трехзонные индикаторные полосы. Индикаторная зона пропитана соединениями 4-1, 4-5, 4-6 (два последних – закреплены ковалентно), реагентная – смесью 4-аминобензойной и щавелевой или лимонной кислот, насосная зона состоит из хроматографической бумаги (рис. 7). Полоса запаяна в полиэтилен. Метрологические характеристики визуальных тест-методик обнаружения и определения NO2- оценены статистическим методом (табл. 4). Цветовая шкала сравнения представлена на рис. 8.


Таблица 4. Чувствительность (определяемый смин) трехзонных полос на нитрит-ионы. Диазосоставляющая – 4-диазобензойная кислота

Индикаторная зона

Индикатор

смин, мг/л

Сорбфил ПТСХ-В

4-1

0.08

Бумага целлюлозная

4-5

0.05

Силуфол

4-6

0.1






Рис. 7. Трехзонная индикаторная полоса. 1 – индикаторная зона, 2 – реагентная зона, 3 – насосная зона




0

0.05

0.1

0.2

0.5

1

2

5

мг/л

Рис. 8. Цветовая шкала для определения нитрита трехзонной полосой с ковалентно закрепленным индикатором























Глава 5. Тест-средство для определения пероксида водорода. Для тест-определения пероксида создано бесферментное тест-средство, устойчивое в течение длительного времени, не зависящее от условий хранения, полученное многоступенчатым матричным синтезом медных комплексов гетерилгидразидинилцеллюлоз, способных давать обратимые окислительно-восстановительные реакции с контрастным цветовым переходом. При поиске новых окислительно-восстановительных индикаторов мы обратились к такой хромогенной хелатной структуре, как формазанат меди, в которой и лиганд, и металл проявляют окислительно-восстановительные свойства.

Формазаны под действием восстановителей, таких как сульфиды, распадаются до амидразонов и аминов. Нами показано методом ЭПР (рис. 9), что комплексы меди (II) с листовыми полидентатными 1-(2-карбоксифенил)-5-гетерилформазанил-6-целлюлозами, где гетерил – 4-метил-6-метоксипиримидин-2-ил (РИБ 5-5), 4,6-диметилпиримидин-2-ил (РИБ 5-6), бензоксазол-2-ил (РИБ 5-7), бензтиазол-2-ил (РИБ 5-8), имеющими состав лиганд : Сu2+ = 1 : 1 и лигандную конфигурацию вытянутого октаэдра, под действием сульфида ведут себя иначе: медь меняет степень окисления с +2 до +1, но при этом не вступает в реакцию с образованием сульфида меди; а хромофорная азогруппа восстанавливается до гидразогруппы без расщепления связи азот-азот с образованием ранее не известных комплексов меди (I) c 1-(2-карбоксифенил)-5-гетерилгидразидинил-6-целлюлозами, где гетерил – 4-метил-6-метоксипиримидин-2-ил (РИБ 5-1), 4,6-диметилпиримидин-2-ил (РИБ 5-2), бензоксазол-2-ил (РИБ 5-3), бензтиазол-2-ил (РИБ 5-4); при этом цветные реакции обратимы.



^ Рис. 9. Спектры ЭПР комплексов меди (II) с 1-(2-карбоксифенил)-5-(4-метил-6-метоксипиримидинил-2)-формазанилцеллюлозой (РИБ 5-5) (1), продукта ее восстановления 1-(2-карбоксифенил)-5-(4,6-диметилпиримидинил-2)-гидразидинилцеллюлозы (РИБ 5-1) (2) и продукта окисления РИБ 5-1 пероксидом (РИБ 5-5) (3).


Таким образом, нами получены РИБ 5-1–5-4, которые пригодны в качестве индикаторов для бесферментного тест-метода определения пероксида, под действием которого они переходят соответственно в интенсивно окрашенные РИБ 5-5–5-8, их размытые максимумы электронных спектров поглощения охватывают практически всю видимую область спектра. В то же время у их близких аналогов, в которых карбоксигруппа замещена на водород, сульфогруппу или гидроксигруппу, окислительно-восстановительные реакции или мало контрастны, или не протекают вообще. Из гетерилрадикалов наиболее практически интересным оказался 4-метил-6-метоксипиримидинил – относительно слабый хромофор с сильными донорными атомами азота. Это дало возможность получения из РИБ 5-5 продукта ее восстановления – РИБ 5-1 повышенного цвета (λмакс = 430–440 нм, размытый), переходящего при окислении снова в РИБ 5-5 глубокого цвета (λмакс = 580–590 нм, размытый с широким плечом 640–670 нм) с батохромным сдвигом в центре видимой области спектра (рис. 10).



Рис. 10. Спектры поглощения исходной РИБ 5-5 (1), продукта ее восстановления РИБ ^ 5-1 (2) и продукта окисления РИБ 5-1 пероксидом – РИБ 5-5 (3)

На обратимость окислительно-восстановительных реакций указывает то, что спектры ЭПР (рис. 9) РИБ ^ 5-5 (исходного продукта для восстановительного синтеза РИБ 5-1) и РИБ 5-5 (продукта окисления РИБ 5-1 пероксидом) полностью идентичны и указывают на валентность меди (II), а спектр ЭПР РИБ I – на валентность меди (I).

Предложенная нами технология получения РИБ – закрепление аналитического реагента на поверхности бумаги-основы для экспресс-тестов, приводит к нерегулярной полидентатной целлюлозе со средней сниженной статической обменной емкостью по сравнению с волокнами, но повышенной у поверхности РИБ. При такой структуре РИБ чувствительность тест-реакции значительно выше по сравнению с равномерно прокрашенной целлюлозой, так как внутри бумаги не маскируется часть определяемого металла. Отделенный специальным приемом реагентный слой РИБ желтого цвета и комплекс РИБ с медью(II) темно-синего цвета от внутреннего непривитого целлюлозного слоя составляет по массе около 25 %. Этот слой использовали для снятия спектров ИК и ЭПР.

РИБ получали взаимодействием соответствующих гетерилгидразидинилцеллюлоз с диазотированной антраниловой кислотой, а их комплексы с медью (II) – обработкой полученных РИБ раствором CuSO4 при рН 2–7.

РИБ на основе комплексов меди (I) с листовыми полидентатными 1-(2-карбоксифенил)-5-гетерилгидразидинил-6-целлюлозами; где гетерил – 4-метил-6-метоксипиримидин-2-ил (РИБ 5-1), 4,6-диметилпиримидин-2-ил (РИБ 5-2), бензоксазол-2-ил (РИБ 5-3), бензтиазол-2-ил (РИБ 5-4), получены восстановлением РИБ на основе комплексов меди (II), путем их погружения в 1%-ый раствор сульфида натрия на 1 минуту, последующего подкисления раствора до рН 3 уксусной кислотой, а затем промывкой водой и этанолом (схема 3).


Схема 3



5-55-8

5-1–5-4

Het1









5-1

5-2

5-3

5-4

Het2









5-5

5-6

5-7

5-8


Тест-определение пероксида осуществляли погружением индикаторной полосы концом с РИБ в исследуемый раствор на 1 с и после экспозиции на воздухе в течение 1 мин – измерением коэффициента отражения на рефлектометре с применением градуировочных графиков. По результатам испытания модельных систем на рефлектометре относительно разных фонов были построены градуировочные графики с использованием функции Кубелки-Мунка (табл. 7) и цветовая шкала (рис. 11).


Таблица 7. Уравнения градуировочных графиков для РИБ-пероксид-тест, построенных по функции Кубелки-Мунка. Спектры сняты при светодиоде 660 нм.



Уравнение графика

Фон

1

F1(c) = 3.801c + 0.001, R2 = 0.968

РИБ-пероксид-тест

2

F2(c) = 39.163c + 0.680, R2 = 0.979

Белая бумага

3

F3(c) = 39.315c + 1.080, R2 = 0.986

Белая пленка ПВХ




0

0.5

1

2

5

10

20

мг/л

Рис. 11. Цветовая шкала

для определения пероксида

ИП на основе

РИБ-пероксид-тест

0

0.05

0.1

0.2

0.5

1

2

%



















С помощью ИП из РИБ 5-1 (РИБ-пероксид-тест) по градуировочным графикам проводили обнаружение пероксида водорода в фармацевтических и косметических препаратах (табл. 8–10) в интервале 0.5–20 мг/л; sr=0.03–0.20 при P=0.95 и n=3.


Таблица 8. Результаты определения содержания основного вещества в препарате пероксида водорода 3% производства ООО «Иодные технологии и маркетинг» 2009. Градуировочный график по отношению к фону — РИБ-пероксид-тест (1).

P = 0.95, n = 3.

Разбавление в 50 раз

Разбавление в 100 раз



0.303±0.006



0.221±0.003



0.498±0.007



0.601±0.004



0.25±0.01



0.133±0.003

, %

0.066±0.003

sr

0.04

, %

0.035±0.001

sr

0.03

% в исходной

3.30±0.15

% в исходной

3.5±0.1






0.589±0.017

Таблица 9. Результаты определения содержания основного вещества в лабораторном препарате пероксида водорода, хранившемся 6 лет (с 2002 г). Разбавлен в 250 раз. Градуировочный график по отношению к фону – белой бумаге (2). P = 0.95, n=3.



0.258±0.010



1.071±0.069

, %

0.010±0.002

sr

0.20

% в исходной

2.5±0.5


Таблица 10. Результаты определения пероксида водорода в фиксирующем нейтрализаторе Schwarzkopf GmbH, Hamburg, Germany. Градуировочный график по отношению к фону – белой пленке (3). P = 0.95, n = 3.

Разбавление в 100 раз

Разбавление в 200 раз



0.953±0.012



0.793±0.015



0.111±0.003



0.161±0.005



3.544±0.125



2.186±0.101

, %

0.063±0.003

sr

0.051

, %

0.028±0.003

sr

0.101

% в исходной

6.3±0.3

% в исходной

5.6±0.6



Выводы


1. Реализованы три новых подхода к ковалентному закреплению хромогенных аналитических реагентов на твердофазных матрицах на примерах создания тест-средств для определения катиона – алюминия, аниона – нитрита и окислителя – пероксида.


2. Разработан способ получения реагентной индикаторной бумаги на алюминий, основанный на иммобилизации алюминона на модифицированной эпихлоргидрином хроматографической бумаге-основе для экспресс-тестов. Созданы две формы тест-средств: индикаторная бумажная полоса с полимерной державкой на конце для определения 0.005–50 мг/л алюминия в водных растворах и бумажная зона на полимерной подложке для определения 0.1–10 мкг/см2 алюминия на металлической поверхности. Установлено, что строение комплекса соответствует составу алюминий : лиганд = 2 : 2, причем алюминий в тест-реакциях образует комплекс одновременно и с ковалентно, и с адсорбционно закрепленными молекулами алюминона.


3. Созданы тест-средства для определения нитрит-ионов на основе синтезированных неканцерогенных, недерматозных, нетоксичных реагентов группы 3-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-7,8-бензохинолина, в том числе содержащих группировки, активные к взаимодействию с протонодонорными группами твердофазных матриц: N-(2,3-эпоксипропил)-3-гидрокси-7,8-бензо-1,2,3,4-тетрагидрохинолин и N-(3-хлор-2-гидроксипропил)-3-гидрокси-7,8-бензо-1,2,3,4-тетрагидрохинолин, которые были ковалентно закреплены соответственно на бумажную и кремнеземную матрицы. Разработаны тест-методы определения нитрита в природных и потребительских водах в диапазоне 0.05–50 мг/л. Методами ИК-, ЯМР спектроскопии и масс-спектрометрии идентифицированы продукты тест-реакций с нитрит-ионами. Методом РСА установлено, что одним из продуктов реакции азосочетания является не обычное азосоединение, а цвиттер-ион 2-карбоксифенилгидразона 3-гидрокси-7,8-бензо-2,3,4,6-тетрагидро-6-хинолона.


4. Путем многостадийного матричного синтеза ковалентно закреплены комплексы меди(I) с полидентатными гетерилгидразидинилцеллюлозами, в которых и медь, и лиганд обладают окислительно-восстановительными свойствами. Созданы реагентные индикаторные бумаги, способные к многократно обратимым хромогенным окислительно-восстановительным реакциям, и разработан тест-метод для бесферментного определения пероксида водорода в диапазоне 0.05–2%. Методом ЭПР показано, что в ходе тест-реакции медь меняет степень окисления с +1 до +2 с одновременным переходом комплекса 1-(2-карбоксифенил)-5-(4-метил-6-метоксипиримидин-2-ил)-гидразидинилцеллюлозы в комплекс 1-(2-карбоксифенил)-5-(4-метил-6-метоксипиримидин-2-ил)-формазанилцеллюлозы.


5. Установлены метрологические характеристики новых тест-средств для определения алюминия(III), нитрит-ионов и пероксида водорода, имеющие ряд преимуществ перед известными тест-средствами на эти аналиты.


Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1.

Островская В.М., Нефедов С.Е., Цыганков А.В., Прокопенко О.А., Маньшев Д.А. Аналитические реагенты для тест-методов определения нитратов и нитритов и продукты тест-реакций. / II Всероссийский симпозиум «Тест-методы химического анализа» /Тезисы докладов. 21–25 июня 2004. Саратов: «Научная книга». С. 44.




2.

Островская В.М., Цыганков А.В. Сорбционное концентрирование определяемых микрокомпонентов на хромогенных целлюлозах. / II Международный симпозиум "Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии". Материалы. Краснодар. 2005. С. 241–242.





3.

Островская В.М., Маньшев Д.А., Прокопенко О.А., Цыганков А.В. Индикация микрокомпонентов жидких ракетных топлив в полевых условиях с помощью комплекта тест-средств. // Труды 25 ГОСНИИ МО РФ. М. 2005. Выпуск 53. С. 358–369.





4.

Островская В.М., Цыганков А.В., Прокопенко О.А., Никитин А.В., Решетняк Е.А. Индикаторная бумага для определения алюминия в водах и ее метрологические характеристики. / 7-ой международный конгресс "Вода: экология и технология" ЭКВАТЕК-2006. Сборник материалов конгресса. Москва. 2006. Часть II. С. 975–976.





5.
              1. Ostrovskaya V.M., Prokopenko O.A., Manshev D.A., Tsygankov A.V., Reshetnyak E.A. Indicator test strips for the control of corrosion and purity of surface aluminium designs. / International Соngress on Analytical Sciences ICAS 2006. Russia. Moscow. June, 25–30 2006. Book of Abstracts. Volume 1. P. 65–66.





6.
              1. Островская В.М., Ларин Г.М., Зверева Г.А., Цыганков А.В.,Маньшев Д.А., Минин В.М. Комплексы меди с полидентатными гетарилформазанил-целлюлозами. // Координационная химия. 2006. Т. 32. № 1. С. 36–41.





7.

Островская В.М., Цыганков А.В., нефедов С.Е., Прокопенко О.А., Решетняк Е.А. Синтез и строение 3-гидрокси-6-(R-фенил-азо)-7,8-бензо-1,2,3,4-тетрагидро-хинолинов – продуктов аналитических тест-реакций на нитрит и нитрат-ионы. // Известия Академии наук. Серия химическая. 2006. № 6. С. 1–5.




8.

Островская В.М., Золотов Ю.А., Цыганков А.В., Прокопенко О.А., Маньшев Д.А. Реагентная индикаторная бумага для определения алюминия / Пат. РФ 2284520. 2006. Бюл. 27. Приоритет 15.09.2005.


9.

Островская В.М., Решетняк Е.А., Немец Н.Н., Цыганков А.В. Определение алюминия в природных водах с помощью индикаторных полос РИБ-алюминий-тест. / Аналитика России. Материалы II-й Всероссийской конференции с международным участием. Краснодар. 2007. Раздел «Анализ объектов окружающей среды». С. 377.





10.

Островская В.М., Дмитриенко С.Г., Апяри В.В., Цыганков А.В. Генетически связанные реагенты группы 3-гидрокси-7,8-бензо-1,2,3,4-тетрагидрохинолина на нитрит-ионы / XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Москва. 2007. Новые методы и приборы для химических исследований и анализа. Сборник трудов. Т. 4. С. 195.





11.

Островская В.М., Цыганков А.В., Буряк А.К., Прокопенко О.А., Решетняк Е.А., Никитина Н.А. Определение нитрит-ионов тест-полосами на основе 3-гидрокси-7,8-бензо-1,2,3,4-тетрагидрохинолина. // Журнал аналитической химии. 2008. Т. 69. № 8. С. 866-872.





12.

Островская В. М., Зверева Г. А., Минин В. В., Цыганков А. В., Прокопенко О. А., Маньшев Д. А. Окислительно-восстановительные реакции с участием медных комплексов гетарилформазанилцеллюлоз. / XXIV Международная Чугаевская конференция по координационной химии. Санкт-Петербург. 2009. / Тезисы докладов. С. 133–134.




13.

Островская В.М., Маньшев Д.А., Прокопенко О.А., Буряк А.К., Калач А.В., Цыганков А.В., Апяри В.В. Сорбционные процессы при получении и применении тест-полос на основе алюминона. // Сорбционные и хроматографические процессы. 2008. Т. 8. № 5. С. 812-818.




14.

Островская В. М., Цыганков А. В., Прокопенко О. А., Маньшев Д. А. Высокочувствительные тест-методы определения компонентов ракетных окислителей в водных объектах с применением неканцерогенных индикаторов. / Международный конгресс «Вода: технология и экология» ЭКВАТЭК-2008. Москва. 2008. МВЦ «Крокус Экспо». Сборник статей.




15.

Островская В. М., Прокопенко О. А., Цыганков А. В. Тест-метод определения пероксида с помощью комплекса меди (I) с 1-(2-карбоксифенил)-5-(4-метил-6-метоксипиримидин-2-ил)-гидразидинилцелюлозы / Аналитическая химия – новые методы и возможности. Съезд аналитиков России и школа молодых ученых. Москва. 2010 / AbsN_257. С. 214-215.









Скачать 400,6 Kb.
оставить комментарий
Дата28.09.2011
Размер400,6 Kb.
ТипАвтореферат диссертации, Образовательные материалы
Добавить документ в свой блог или на сайт

Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Разместите кнопку на своём сайте или блоге:
rudocs.exdat.com

Загрузка...
База данных защищена авторским правом ©exdat 2000-2017
При копировании материала укажите ссылку
обратиться к администрации
Анализ
Справочники
Сценарии
Рефераты
Курсовые работы
Авторефераты
Программы
Методички
Документы
Понятия

опубликовать
Загрузка...
Документы

наверх