Автореферат разослан 2011 г icon

Автореферат разослан 2011 г


Загрузка...
страницы:   1   2   3
скачать


На правах рукописи


ЯКУПОВ ТАЛГАТ РАВИЛОВИЧ


МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ

МЕТОДЫ В ДИАГНОСТИКЕ, ИНДИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ТУБЕРКУЛЕЗА И ЛЕЙКОЗА

КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА


06.02.02. - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,

микология с микотоксикологией и иммунология


А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени

доктора ветеринарных наук


Казань - 2011


Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия

ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана»


^ Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор

Алимов Азат Миргасимович


Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Юсупов Расых Халиулович


доктор ветеринарных наук, профессор

Байматов Валерий Нурмухаметович


доктор медицинских наук, профессор

Поздеев Аскар Кимович


^ Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский

институт бруцеллеза и туберкулеза животных

Сибирского отделения Российской академии

Сельскохозяйственных наук» (ГНУ «ВНИИБТЖ»)


Защита диссертации состоится «_____» ________2011 г. в «___» часов на заседании диссертационного совета Д 220.034.01 при ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана» по адресу: 420029, г.Казань, ул.Сибирский тракт, д.35.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана».


Автореферат разослан «____» _________ 2011 г.


Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор ветеринарных наук А.К.Галиуллин



  1. ^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Туберкулез и лейкоз крупного рогатого скота наиболее распространенные хронические инфекции в животноводстве и представляют собой важные проблемы не только ветеринарной медицины, животноводства, но биологии и экологии в целом и имеющие непосредственное отношение к безопасности здоровья человека. На современном этапе борьбы с туберкулёзом и лейкозом животных, основой профилактических и оздоровительных мероприятий была и остаётся своевременная и точная диагностика этих инфекций.

Огромный вклад в изучение эпизоотологии, диагностики и ликвидации туберкулеза сельскохозяйственных животных внесли такие ученые как М.Н.Верещагин (1926), П.П.Вишневский (1935), М.К.Юсковец (1963), О.В.Мартма (1971), В.П.Урбан (1980), М.А.Сафин (1980), Д.Д.Новак (1984), Н.М.Колычев (1992), А.С.Донченко (1993, 1995), В.Г.Ощепков (2001), Н.А.Донченко (2008), А.Х.Найманов (2009) и другие.

Диагноз на туберкулез ставят комплексным методом на основе эпизоотологических, клинических, аллергических, патологоанатомических и лабораторных исследований. Однако не возможно выделить какой-либо один метод диагностики туберкулеза, имеющий значительные преимущества перед другими, скорее они могут взаимодополнять друг друга и поэтому имеют право на существование (С.И.Татьков и др.,2006; В.А.Сазонов и др. 1996). По мнению А.М.Лысенко (1987), Е.В.Маслова (1986), Armbrust А. (1988) и др., для диагностики туберкулеза животных наиболее перспективен иммуноферментный анализ, который позволяет ставить диагноз на туберкулез в лабораторных условиях одновременно у большого количества животных, прост в применении и обладает высокой чувствительностью и специфичностью. В связи с этим, получение и изучение антигенных и иммуногенных характеристик микобактериальных антигенов, специфических антител, возможностей их использования для диагностики туберкулеза, дифференциации неспецифических реакций животных на туберкулин в иммунохимических реакциях являются актуальной задачей для ветеринарной практики в плане повышения эффективности диагностики, индикации и идентификации возбудителей туберкулеза крупного рогатого скота.

Определение современными методами уровня и спектра противотуберкулезных антител далеко не исчерпало себя в качестве средства иммунодиагностики и характеристики особенностей течения туберкулеза, а сами противотуберкулезные антитела не достаточно используются для характеристики микобактериальных антигенов, приготовления диагностикумов и других целей (Л.Н.Черноусова и др., 1995, 2000). Разработка экспресс-методов индикации и идентификации возбудителя туберкулеза из биоматериала животных и дифференциации патогенных микобактерий от атипичных остается актуальной задачей научных исследований (А.Н.Шаров и др., 2000, 2003; М.С.Калмыкова, 2007). Более преспективной в этом отношении, наряду с методами иммуноферментного анализа, является полимеразная цепная реакция (ПЦР). В настоящее время, в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота и идентификации микобактерий, интенсивно разрабатываются различные подходы по применению ПЦР и других приемов генодиагностики (С.Н.Радюк, Г.Р.Мацевич, 1997; Е.Б.Вишневская, 1998; А.Н.Шаров, В.А.Седов, 1998; А.М.Алимов, 1999; А.Х.Найманов и др., 2004; Н.А.Донченко, 2008 и др.).

В структуре инфекционной патологии лейкоз крупного рогатого скота в РФ занимает лидирующее место и составляет более 50% от других нозологий (М.И.Гулюкин, 2003; А.М.Смирнов, 2005). Широкая распространенность лейкоза крупного рогатого скота, отсутствие средств терапии и специфической профилактики определяют актуальность научных исследований по этой проблеме (Г.А.Симонян, 1975; В.А.Бусол, 1983; М.И.Гулюкин, 2003; Л.Г.Бурба, А.Ф.Валихов, 1985; В.М.Нахамсон, 1986; П.Н.Смирнов, 1986; И.М.Донник, 1999; В.В.Храмцов, М.А.Амироков, 2005; А.М.Алимов, 2010).

Одним из приоритетных направлений исследований по изучению особенностей и закономерностей инфекционного процесса лейкоза крупного рогатого скота является разработка высокочувствительных методов прижизненной диагностики болезни (В.А.Бусол, 1997; Р.В; О.А.Верховский и др., 2002; М.И.Гулюкин, В.А.Храмцов, А.С, Донченко и др., 2002; В.И.Околелов и др., 2003; П.Н.Смирнов, 2008; М.И.Гулюкин, 2008; И.М.Донник и др., 2009).

В настоящее время, согласно стандартам МЭБ, узаконенными методами диагностики лейкоза крупного рогатого скота являются реакция иммунодиффузии в геле агара и метод иммуноферментного анализа.

Важным преимуществом иммуноферментных методов, наряду с более высокой чувствительностью и специфичностью, является то, что ИФА позволяет выявлять специфические антитела в пробах сборного молока. Если учесть доступность и простоту выполнения, то ИФА для выявления специфических антител в пробах молока может стать важнейшим элементом в системе противолейкозных мероприятий в хозяйствах (Nguyen V.K., Maes R.F., 1992; Sargeant J.M., Kelton D.F et al., 1997).

Весьма актуальной задачей является изучение иммунологических аспектов патогенеза лейкоза крупного рогатого скота. Определение динамики образования и спектра антител, идентификация и изучение состава иммунных комплексов способствуют расшифровке молекулярно-клеточных механизмов взаимодействия вируса лейкоза с макроорганизмом и объяснению особенностей патогенеза.

Результаты подобных исследований явятся основой для разработки новых высокоспецифичных и ранних методов выявления инфицированности животных возбудителями туберкулеза и лейкоза, а также для создания более надежной системы мер борьбы с этими опасными инфекционными болезнями.

^ Цель и задачи исследования. Целью нашей работы явилось усовершенствование иммунохимических и молекулярно-генетических методов диагностики туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота, а также средств индикации и идентификации возбудителей этих инфекций. В соответствии с целью решались следующие задачи:

- изучить антигенную структуру микобактерий и усовершенствовать способы получения антигенных препаратов;

- изыскать способы получения высокоспецифичных антигенов микобактерий и антител, обеспечивающих индикацию и идентификацию микобактерий в патологическом материале, и дифференциацию неспецифических реакций на туберкулин методом ИФА;

- определить эффективность иммуноферментного анализа для выявления специфических антител при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота;

- определить диагностическую ценность ИФА и ПЦР в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота;

- изучить динамику образования специфических антител и циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота;

- разработать ИФА для выявления специфических антител к ВЛКРС в сыворотке крови и молоке, и определить его диагностическую ценность;

- изучить динамики антителогенеза у крупного рогатого скота к различным структурным компонентам вируса лейкоза;

^ Научная новизна. Иммунохимическими и биохимическими методами изучена антигенная структура микобактерий и разработаны способы получения высокоспецифичных антигенов из инактивированных культур и антител к ним, обеспечивающих индикацию и идентификацию микобактерий в патологическом материале, дифференциацию неспецифических реакций на туберкулин. Установлено, что особенности антителогенеза, диссоциация циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке, обнаружение провирусной ДНК в их составе являются важными факторами повышения эффективности диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Впервые разработан способ получения антигенов микобактерий, обеспечивающих дифференциальную диагностику туберкулеза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа («Способ получения антигена для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота» – положительное решение о выдаче патента РФ на изобретение от 12.08.2010г., заявка №2009112145).

Показана высокая информативность разработанного ИФА для выяснения эпизоотической ситуации хозяйств по туберкулезу крупного рогатого скота.

Разработана технология повышения специфичности иммунных сывороток к микобактериальным антигенам, обеспечивающая индикацию и дифференциацию микобактерий в патологическом материале методом иммуноферментного анализа («Белково-глутаральдегидный метод очистки иммунной сыворотки против M.bovis» – рационализаторское предложение №314-91 от 5.03.1991).

Разработан ИФА для выявления специфических антител к ВЛКРС в сыворотке крови и молоке с предварительной диссоциацией циркулирующих иммунных комплексов в пробах («Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота» – заявка на патент РФ №2010100016, приоритетная справка от 11.02.2010г.) и определена его диагностическая ценность. Установлено, что иммуноферментный анализ с предварительной диссоциацией иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке увеличивает выявляемость инфицированных ВЛКРС животных на 20%.

Впервые изучена динамика образования и спектр свободных антител и циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке коров инфицированных ВЛКРС в естественных условиях. Установлено, что при уменьшении титров свободных антител в сыворотке крови повышается уровень циркулирующих иммунных комплексов. На разных стадиях развития иммунитета при лейкозе крупного рогатого скота спектр антител меняется. Данные факты свидетельствует о том, что разовые серологические тесты, основанные на выявление антител против только одного антигена, в диагностике лейкоза могут быть не эффективными.

Впервые методом полимеразной цепной реакции доказано присутствие в составе циркулирующих иммунных комплексов провирусной ДНК ВЛКРС, что расширяет представления о патогенезе инфекции и способствует дальнейшему совершенствованию методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

^ Практическая значимость работы. Разработанный способ выделения специфических микобактериальных антигенов повышает эффективность прижизненной дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота иммунологическими методами.

«Набор препаратов для выявления антител к возбудителю туберкулеза крупного рогатого скота методом ИФА» и «Тест-система иммуноферментная для типизации микобактерий в патологическом материале» позволяют выяснить эпизоотическую ситуацию по туберкулезу в хозяйствах, и рекомендуются для включения в комплексную систему мероприятий по борьбе с туберкулезом крупного рогатого скота.

Разработанный иммуноблот анализ микобактериальных антигенов позволяет идентифицировать микобактерии и может быть использован в качестве дополнительного теста для диагностики туберкулеза.

Для повышения выявления инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота целесообразно проводить ИФА с предварительной диссоциацией циркулирующих иммунных комплексов. Разработанный метод ИФА с предварительной диссоциацией ЦИК в исследуемых пробах открывает широкие перспективы для диагностики данной инфекции методом иммуноферментного анализа молока.

Результаты научных исследований успешно апробированы и внедрены в хозяйствах Буинского, Дрожжановского, Зеленодольского, Черемшанского, Тюлячинского, Нижнекамского, Высокогорского, Арского и др. районов РТ. По результатам исследований подготовлены методические рекомендации, направленные на усовершенствование методов диагностики туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота, утвержденные НТС КГАВМ, ГУВ КМ РТ:

«Тест-система иммуноферментная для выявления специфических антител против микобактерий» - утверждены НТС КВИ, протокол №5 от 22.05.92г.

«Тест-система иммуноферментная для типизации микобактерий» - утверждены НТС КВИ, протокол №5 от 22.05.92г.

Методические рекомендации по диагностике лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа сыворотки крови и молока, утвержденные НТС ГУВ КМ РТ, протокол №1 от 21.01.2008г.

Методические рекомендации по оценке благополучия хозяйств по лейкозу крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа, утвержденные НТС ФГОУ ВПО «КГАВМ», протокол № 2 от 4.06.2009. и НТС ГУВ КМ РТ, протокол № 3 от 8.10.2010г.

Методические рекомендации по применению микобактериальных антигенов в ИФА для дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота, утвержденные НТС ФГОУ ВПО «КГАВМ», протокол № 5 от 15.12.10г. и НТС ГУВ КМ РТ, протокол № 4 от 20.12.2010г.

Методические рекомендации по оценке благополучия хозяйств по лейкозу крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа и по применению микобактериальных антигенов в ИФА для дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота представлены в Федеральную службу по ветеринарному и фитосанитарному надзору МСХ РФ для утверждения в установленном порядке.

^ Апрбация работы. Результаты диссертационной работы доложены и одобрены на республиканских и Всероссийских научно-производственных конференциях по актуальным проблемам агропромышленного комплекса (Казань, 1989, 1990, 1991, 1993, 1999, 2004, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010); Всесоюзной научно-технической конференции «Современные проблемы иммунологии, биотехнологии, генной и клеточной инженерии в ветеринарной медицине» (Н.Новгород, 1990); межвузовской научно-производственной конференции молодых ученых «Вклад молодых ученых и специалистов в научно-технический прогресс с/х производства» (Ставрополь, 1991); международной научной конференции посвященной 125-летию КГАВМ (Казань, 1998); международной научной конференции «Проблемы инфекционных и инвазионных болезней в животноводстве на современном этапе» (Москва, 1999); международной научно-производственной конференции посвященной 100-летию членкора ВАСХНИИЛ В.Т.Котова (Воронеж, 1999); республиканских научно-производственных конференциях молодых ученых и специалистов (Казань, 1998, 2000); международной научной конференции посвященной 70-летию зооинженерного факультета КГАВМ (Казань, 2000); международной научной конференции «Энтузиазм и творчество студентов в развитии науки» (Троицк, 2000); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии» (Киров, 2007); Международной научно-производственной конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии» (Москва, 2008); II-м съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997); IV-м съезде Российского общества биохимии и молекулярной биологии (Новосибирск, 2008). Международной научно-практической конференции посвященной 90-летию кафедры биологической и органической химии СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2009).

^ Публикация результатов исследований. Основные результаты исследований, выполненные по теме диссертации, опубликованы в 42 печатных работах, в том числе в 10 изданиях, рекомендованных ВАК, таких как «Ветеринарный врач», «Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии», «Ученые записки КГАВМ».

^ Основные положения, выносимые на защиту:

- изучением антигенной структуры микобактерий получены высокоспецифичные антигены и антитела для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа.

- полимеразная цепная реакция и иммуноферментный анализ на основе очищенных антигенов и антител повышают эффективность диагностики туберкулеза и лейкоза, обеспечивают дифференциацию неспецифических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота, а также индикацию и типизацию микобактерий в патологическом материале.

- инфекционный процесс при лейкозе крупного рогатого скота сопровождается синтезом антител к различным компонентам вируса, уровень которых варьирует в зависимости от стадии болезни.

- диссоциация циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке, обнаружение провирусной ДНК в их составе повышают эффективность диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

^ Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 296 страницах стандартного компьютерного набора, содержит 41 таблицу и 23 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, заключения и выводов, предложений производству, списка литературы и приложений.

Библиографический список использованной литературы включает 394 источников, в том числе 180 на иностранных языках. Прилагаются акты производственных и комиссионных испытаний, акты внедрения, патенты на изобретение, методические рекомендации и другие документы, подтверждающие результаты исследований, их научно-практическую ценность.

^ Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. В выполнении отдельных этапов работы принимали участие: д.б.н. В.П.Коксин, к.б.н. К.С.Хаертдинов, к.в.н. Усольцев, к.б.н. Зиннатов Ф.Ф.

Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методической помощи научному консультанту д.в.н., профессору А.М.Алимову, д.в.н., профессору кафедры биохимии КГАВМ Н.З.Хазипову, ректору ФГОУ ВПО КГАВМ, д.в.н., профессору Г.Ф.Кабирову.


^ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования по теме диссертации проводились в период с 1990 по 2010 гг. на кафедре неорганической и биологической химии ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана», в лаборатории ОКИБ Республиканского центра по борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями МЗ РТ, в Республиканской ветеринарной лаборатории при ГУВ РТ, ООО «Правда» Высокогорского района.

Экспериментальные и научно-производственные опыты проведены в соответствии с установленными требованиями к эксперименту по подбору аналогов и постановке контроля, соблюдению одинаковых условий кормления и содержания животных

Объем работы и методы исследований определялись в зависимости от поставленных задач. Пробы крови, сыворотки крови и молока от крупного рогатого скота получали из благополучных и неблагополучных по туберкулезу и лейкозу хозяйств республики Татарстан. Патологический материал (заглоточные, средостенные, брыжеечные лимфоузлы) получали от поступившего на Казанский мясокомбинат крупного рогатого скота и от проб, поступивших для анализа в республиканскую ветеринарную лабораторию.

Таблица 1 - Объем выполненных исследований

Вид исследований

Количество проб

ИФА для выявления антител к микобактериям в сыворотке крови

5273

ИФА для выявления антител к ВЛКРС в сыворотке крови

568

ИФА для выявления антител к ВЛКРС в молоке

710

ИФА для выявления микобактериальных антигенов в патматериале

69

Проведение ПЦР

885

Проведение иммуноблот анализа

49

Автоклавированные культуры микобактерий M. bovis, M.avium, M.nonchromogenes, M.scotochromogenes получены из Курской биофабрики. В опытах был использован штамм M.bovis BCG – коммерческий, производство ФГУП «Аллерген» (г. Ставрополь).

Иммуноферментный анализ ставили по стандартной методике в твердофазном неконкурентном варианте. Использовали микротитрационные планшеты для иммунологических реакций, изготовленные ВНИИ и МТ (г.Москва), а также планшеты полистироловые для иммуноферментного анализа производства «Медполимер» (г.Санкт-Петербург).

Коньюгат. Использовали антитела диагностические против иммуноглобулинов крупного рогатого скота, меченные пероксидазой, изготовленные МТО «Инциатива», прикладная биохимическая лаборатория г.Щелково, антитела диагностические проти IgG кролика, быка меченые пероксидазой, выпускаемые ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН (фелиал «Медгамал»), Anti-Bovine IgG-Peroxidase, antibody produced in rabbit – производства фирмы «Сигма».

Иммуноферментный анализ для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, а также для изучения антигенной общности ВЛКРС и ВИЧ, проводили с использованием «Набора для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС)» производства НПО «Нарвак», и «Тест-системы иммуноферментной для выявления антител к вирусам иммунодефицита человека 1 и 2 типов» производства ЗАО «Вектор-бест». Учет результатов реакции проводили согласно инструкции диагностического набора.

Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали коммерческие тест-системы:

1.Тест-система для индикации и дифференциации M.bovis и M.tuberculosis НПО «Нарвак» (г.Москва), «МТБ-com» (ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ, г.Москва).

2. «Лейкоз-КРС-Провирус» для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, ФГУН ЦНИИЭ – фирмы «АмплиСенс», Gene Pak (фирмы «Biokom).

Изучение спектра антител в исследуемых пробах сывороток крови коров проводили методом иммуноблот анализа. Иммуноблотинг проводили на тест-системе “New LAV BLOT” фирмы Bio Rad (США). Денситометрию результатов иммуноблоттинга проводили в отраженном свете на сканере “Sharp Ix-330”. В анализе денситограмм была использована программа “Image Master ID Prime” фирмы “Pharmacia Biotech.

^ Получение микобактериальных антигенов. Автоклавированную микобактериальную массу отмывали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин 5 раз в физиологическом растворе. Для удаления свободных липидов, микробные клетки дважды обрабатывали ацетоном в соотношении 1:2, помещая их в термостат при 370С на 1,5 часа и периодически перемешивая. По истечении этого времени, методом центрифугирования при 5000 об/мин в течение 15 мин, микробные клетки отделяли и подсушивали на воздухе. Обработанные ацетоном микробные клетки заливали раствором диметилсульфоксида (ДМСО) подогретым до 370С, из расчета 6 мл на 1г бактерий и встряхивали в течение 30 мин при 370С, после чего микробные клетки отделяли центрифугированием в том же режиме. Экстракт диализировали против 0,01 М карбонатного буфера (рН 9,6) в течение двух суток. Диализат использовали в качестве антигена в дальнейших исследованиях (ДМСО-антиген).

^ Электрофоретическое фракционирование антигенов. Диск-электрофорез антигенов проводили по методу Laemli (1970) в пластинчатом полиакриламидном геле с использованием детергента додецилсульфата натрия и восстановителя разрыва по S-S связям -  мекркаптоэтанола. Молекулярные массы белков, содержащихся в антигенных препаратах, определяли в соответствии с разгонкой белковых стандартов (Broad range – изготовитель Сигма и био-Рад) по логарифмической кривой длины пробега маркеров по K.Weber, M.Osborn (1969) и Н.М.Филлипович (1978), а также инструментально при помощи оптического сканирования и денситометрирования с дальнейшей компьютерной обработкой данных с использованием программы Image master.

^ Хроматографическое фракционирование антигенов. Фракционирование проводили методом гель-хроматографии и ионообменной хроматографии

на базе ДЕАЕ-целлюлозы. Подготовка ДЕАЕ-целлюлозы проводилась по общепринятой методике. Использовали хроматографические колонки с внутренним объемом 300 см3. Параметры градиентного элюирования определялись опытным путем. Для гель-хроматографии использовали колонку 4,5 х 60 см с сефадексом G-100 и уравновешенную 0,05М Nа-фосфатным буфером (рН 6,5), содержащим 0,1М NaCl. Процесс элюирования фракций и регистрация результатов производился с помощью УФ-детектора UVICORD –2, сбор фракций осуществлялся на коллекторе фракций FRAC –100.

^ Проведение иммуноблотинга. Электроперенос белков фракционированных в ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану проводили по методике, описанной Towbin et al. (1989). Полиакриламидный гель погружали в трис буфер рН 10,5 на 30 минут, нитроцеллюлозную мембрану выдерживали в трис-глициновом буфере рН 8,8 – 5 минут, по истечении этого времени собирали сендвич (фильтровальная бумага – гель – НЦМ – фильтровальная бумага) и помещали его между анодом и катодом. Перенос проходил в течение 2,5 часа при напряжении в 100 V и силе тока 100мА на пластинку с охлаждением при помощи хладагентов (Coolpack MC-3 Iaminarmedica).

Иммуноблот анализ проводили следующим образом: нитроцеллюлозную мембрану нарезали на полоски – стрипы, маркировали, помещали их в пластиковые канавки, вносили 2 мл ФСР-Т, выдерживали 5 минут, вносили по 10 мкл исследуемых сывороток на стрип, выдерживали 2 часа при комнатной температуре на шейкере, 3 раза промывали раствором ФСР-Т с 5 минутной инкубацией, после каждой промывки раствор аспирировали в дезинфекционную емкость с 6% перекиси водорода, вносили конъюгат в рабочем разведении, инкубировали 1 час при комнатной температуре на шейкере, стрипы 3 раза промывали раствором ФСР-Т, вносили субстратный, инкубировали до развития цветного окрашивания 15-30 минут, 3 раза промывали дистиллированной водой и высушивали. Учет реакции проводили визуально и инструментально при помощи оптического сканирования и денситометрирования по интенсивности окрашивания с использованием компьютерной программы Image master, версия 1.

^ Получение иммунных сывороток против микобактериальных антигенов. В качестве продуцентов гипериммунной сыворотки использовали кроликов. Иммунизацию животных проводили по методу, описанному Harboe N., Ingild A. (1977). Готовили раствор антигена в концентрации 2-4 мг/мл с неполным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1. На 1-й, 14-й, 28-й и 43-й день иммунизации кроликам вводили раствор антигена в объеме 1 мл. Инъекцию производили в утолщенный участок кожи над лопаткой в 8-10 точках. На 50-й день отбирали кровь из ушной вены. Через каждые шесть недель брали очередную порцию крови, причем животному вводили стандартную смесь антигена за 8-10 дней до отбора крови. Специфичность полученных антисывороток изучали в динамике в РСК и ИФА с антигеном из гомологичных и гетерологичных бактериальных клеток.

^ Выделение микобактериальных антигенов из тканей патологического материала крупного рогатого скота. Проводили обработку патологического материала, с целью выделения микобактериальных антигенов, по методу описанному Хазиповым Н.З., Тюриковой Р.П., Нуруллиным А.А. (1986).

Для анализа брали 1-2 г лимфатических узлов (средостенных, заглоточных, брыжеечных и др.) и растирали их кварцевым песком в ступке. Разрушенную ткань суспендировали в гипотоническом растворе NaCl состоящем на 20 % от 0,05 %-го раствора MgCl2 и тщательно перемешивали. К полученной смеси добавляли равный объем физиологического раствора и перемешивали еще 10 мин. Суспензию сливали в узкогорлую колбу на 50 мл, добавляли 1 мл углеводорода (керосин), закрывали плотно резиновой пробкой и энергично встряхивали 10-15 минут. Добавляли в колбу дистиллированной воды до горлышка и оставляли смесь при комнатной температуре на 2 часа. По истечении этого времени с поверхности жидкости отбирали сливкообразный слой, помещали его в центрифужную пробирку, центрифугировали при 8000 об/мин 20 минут. Жидкую фазу сливали, а плотную (пленку) заливали, двойным объемом ацетона и выдерживали при 370С 30-40 минут. После центрифугирования при 4000 об/мин 20 минут ацетон сливали. Этот процесс повторяли дважды. Выделенные фракции после высушивания при комнатной температуре обрабатывали ДМСО и исследовали в ИФА.

^ Постановка иммуноферментного анализа. Иммуноферментный анализ (ИФА) по определению специфических антител к микобактериям осуществляли в непрямом варианте на полистироловых планшетах для иммунологических реакций по методу, описанному Woller A. et al. (1976).

В лунки планшета вносили по 100 мкл растворов антигенов в 0,01 М карбонатном буфере (рН 9,6) и инкубировали 16-18 часов при комнатной температуре. После 3-х кратного промывания раствором для промывки в лунки вносили по 100 мкл исследуемых и контрольных сывороток разведенных в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) с рН 7,3. Инкубировали 1 час при 370С и промывали 3-4 раза. После этого в лунки вносили по 100 мкл конъюгата, разведенного в том же буфере. Инкубировали планшет в течение 30 мин при 370С, промывали лунки планшета не менее 5 раз и вносили в каждую лунку по 100 мкл раствора субстрата. После выдерживания планшет в течение 15 минут при 370С, реакцию останавливали добавлением 50 мкл 2н раствора серной кислоты в каждую лунку.

Учет результатов реакции ИФА проводили на вертикальном сканирующем спектрофотометре. Для оценки результатов реакции использовали коэффициент специфичности (К), который равняется отношению величины оптической плотности исследуемой пробы (ОП0) на величину оптической плотности контрольной пробы (ОПк). Положительно реагирующими считали пробы с К более 2 при разведении 1:200.

^ Выделение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Циркулирующие иммунные комплексы были выделены методом преципитации в полиэтиленгликоле (ПЭГ). Пробы смешивали в соотношении 1 : 1 с 7% раствором ПЭГ-6000 в 0,1М боратном буфере (рН 8,8), перемешивали и инкубировали при +4оС в течение 72-х часов. Преципитат осаждали центрифугированием при 5000g в течение 20 минут и трижды промывали десятикратным объемом ПЭГ в концентрациях: 3,5%, 7% и 10,5% в боратном буфере. Выделенные иммунные комплексы растворяли в физиологическом растворе и изучали их активность в ИФА. Комплексы разбивали с предварительной инкубацией проб при 50оС в течение 2 часов.

Результаты исследований подвергали математической обработке на ПК с использованием программного комплекса Microsoft Excel 2000. Уровень достоверности полученных данных определяли по критерию Стьюдента.





Скачать 0,56 Mb.
оставить комментарий
страница1/3
А.К.Галиуллин
Дата28.09.2011
Размер0,56 Mb.
ТипАвтореферат, Образовательные материалы
Добавить документ в свой блог или на сайт

страницы:   1   2   3
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Разместите кнопку на своём сайте или блоге:
rudocs.exdat.com

Загрузка...
База данных защищена авторским правом ©exdat 2000-2017
При копировании материала укажите ссылку
обратиться к администрации
Анализ
Справочники
Сценарии
Рефераты
Курсовые работы
Авторефераты
Программы
Методички
Документы
Понятия

опубликовать
Загрузка...
Документы

наверх