Методические рекомендации Минск 2003 удк- 616-002. 5-02: 616. 98 (075. 8)
| скачать Н.С. Морозкина, Н.С. Шпаковская Иммунодиагностика Туберкулеза Минск 2003 МИНИСТЕРСТВО Здравоохранения РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ Белорусский государственный медицинский университет Кафедра фтизиопульмонологии Н.С. Морозкина, Н.С. Шпаковская Иммунодиагностика туберкулеза Методические рекомендации Минск 2003 УДК- 616-002.5-02:616.98 (075.8) ББК – 55.4я73 Т81 А в т о р ы: канд. мед. наук, асс. Морозкина Н.С., канд. биол. наук, вед. научный сотрудник ГУНИИ пульмонологии и фтизиатрии Министерства здравоохранения Республики Беларусь Шпаковская Н.С. Р е ц е н з е н т ы: научный руководитель отдела иммуноморфологических методов исследования НИИ ПиФ МЗ РБ, доктор мед. наук, Л.К. Суркова Утверждено Научно-методическим советом университета в качестве методических рекомендаций _________ 2003 г., протокол № _____ Морозкина Н.С., Шпаковская Н.С. Иммунодиагностика туберкулеза : метод. рекомендации. – Мн.: БГМУ. 2003 – 19 с. Приводится краткое описание тестов оценки иммунного статуса человека. Излагаются отдельные варианты иммунологической реактивности больных туберкулезом в зависимости от формы и стадии болезни. Особое внимание уделяется методам иммунодиагностики туберкулеза. Предназначается для студентов IV-V-VI курсов педиатрического, лечебного и медико-профилактического факультетов, а также для врачей-стажеров. УДК- 616-002.5-02:616.98 (075.8) ББК – 55.4я73 ^ Общее время занятия: 3 часа Мотивационная характеристика темы Тема «Иммунодиагностика туберкулеза» является одним из разделов темы занятия: туберкулинодиагностика; методы определения специфической сенсибилизации организма; значение иммунологических тестов в диагностике, определении активности туберкулезного процесса и оценке эффективности лечения. Современная диагностика любого инфекционного заболевания, в том числе и туберкулеза, основывается на обнаружении возбудителя болезни или его специфических маркеров (антигенов, антител). От сроков установления правильного клинического диагноза, назначения адекватного лечения зависят эффективность терапии, прогноз заболевания и часто - жизнь больного. Нередко общепринятый доступный комплекс клинико-рентгенологических и лабораторных исследований не позволяет выявить туберкулезную этиологию процесса и провести дифференциальную диагностику туберкулеза. В таких случаях большую практическую ценность приобретают дополнительные специальные методы исследования, результаты которых подтверждают или отрицают предполагаемый диагноз. Среди этих методов важнейшими являются иммунологические. ^ : изучить современные методы иммунодиагностики туберкулеза. Задачи занятия: 1. Закрепить знания по оценке иммунного статуса человека (тесты гуморального и клеточного иммунитета, факторы неспецифической резистентности). 2. Изучить методы иммунологической диагностики туберкулеза. 3. Изучить методы оценки противотуберкулезного иммунитета. 4. Изучить показания к проведению ИФА 5. Научиться давать клиническую оценку результатов иммунологических исследований различных сред организма у больных туберкулезом. Требования к исходному уровню знаний Повторить из патологической анатомии: особенности туберкулезного воспаления; нормальной анатомии: строение иммунной системы человека; иммунологии: иммунокомпетентные клетки, специфические, неспецифические факторы защиты, иммунологические реакции клеточного и гуморального типов. Контрольные вопросы из смежных дисциплин 1. Центральные и периферические органы иммунной системы человека. 2. Лимфоциты, макрофаги, нейтрофилы: их субпопуляции, основные функции. 3. Этапы фагоцитоза. 4. Иммуноглобулины классов М, G, А, секреторный иммуноглобулин А, их биологическая функция. 5. Иммунологические реакции клеточного и гуморального типов. 6. Методы выявления антител в биологических жидкостях организма (РПК, РПГА, ИФА). Контрольные вопросы по теме 1. Иммунокомпетентные клетки и их роль в противотуберкулезном иммунитете. 2. Гуморальный противотуберкулезный иммунитет. 3. Неспецифические факторы защиты организма от инфекции. 4. Тесты I и II уровня оценки иммунного статуса человека. 5. Цели иммунологических исследований во фтизиатрии. 6. Характеристика нарушений иммунитета у больных туберкулезом. 7. Влияние нарушений иммунного статуса больного на течение туберкулезного процесса, прогноз заболевания. 8. Методы иммунодиагностики туберкулеза. 9. Провокационные тесты с антигеном возбудителя в иммунодиагностике туберкулеза (ИФА, РПК, РПГА, РТМЛ). Учебный материал Иммунная система – это система контроля, обеспечивающая индивидуальность и целостность организма за счет способности отличать собственные структуры от генетически чужеродных, перерабатывать и элиминировать последние. Иммунная система обеспечивает прежде всего защиту организма от инфекции. Ключевым этапом в развитии иммунного ответа являются представление распознавание чужеродного антигена (АГ) иммунокомпетентными клетками. Центральным звеном в проявлении резистентности к возбудителю туберкулеза (МБТ) являются СД4+Т-лимфоциты, специфически сенсибилизированные к микобактериальным АГ (антигенным компонентом МБТ, индуцирующим ГЗТ, являются белки; полисахариды и жиры такое действие не оказывают). Вместе с тем, Т-лимфоциты не действуют непосредственно на МБТ. СД4+Т-лимфоциты активируют фагоцитозную и бактериоцидную активность макрофагов, а СД8+Т-клетки способны оказывать прямое цитотоксическое действие на клетки, инфицированные МБТ. Эффекторным звеном противотуберкулезной резистентности служат макрофаги. Туберкулез – классический пример хронического инфекционного заболевания, протекающего с внутриклеточным (в макрофагах) паразитированием МБТ; микобактерии размножаются и гибнут именно в макрофагах. Защитные системы этих клеток лишь ингибируют размножение микроорганизмов, поскольку МБТ, располагаясь внутриклеточно, уклоняются от разрушения лизоцимами, радикалами и реактивными производными азота. Взаимодействие макрофагов с МБТ неспецифическое и требует иммунологического усиления. Такое усиление активности макрофагов контролируется Т-лимфоцитами посредством синтезируемых ими медиаторов. Сенсибилизированные Т-лимфоциты стимулируют миграцию макрофагов в очаги воспаления, повышают фагоцитарную активность и ингибицию МБТ внутри макрофагов. При распространенных формах туберкулеза выявляется дефект антигенспецифического ^ -клеточного ответа Это проявляется в угнетении пролиферации периферических Т-лимфоцитов, снижении содержания Т-хелперных лимфоцитов I типа и интенсивности продуцирования ими интерлейкина-2, -интерферона при стимуляции ППД. Это предопределяет развитие регуляторной, а при углублении патологического процесса – и структурно-функциональной вторичной иммунной недостаточности клеточного типа. Иммунодефициты у больных, при распространенном и прогрессирующем течении патологического процесса, связаны с цитолизом (некрозом) иммунокомпетентных клеток (макрофагов и СД4+ Т-лимфоцитов). Не последнюю роль при этом играет апоптоз лимфоцитов (запрограммированная гибель клеток), особенно СД4+. ^ Изучать иммунный статус (ИС) больных туберкулезом необходимо для решения ряда практических задач, в частности, для: 1.Диагностики и дифференциальной диагностики туберкулеза. 2.Определения активности процесса и прогноза заболевания. 3.Контроля за эффективностью лечения. 4.Выявление глубины нарушений иммунитета с целью иммунокоррекции. ИС человека можно охарактеризовать комплексом информативных показателей, отражающих состояние различных звеньев системы иммунитета в момент исследования при конкретном заболевании. Оценка ИС организма заключается в поиске основного дефекта, который может локализоваться в различных звеньях лимфоидной системы (Т- и В-лимфоцитах и их субпопуляциях, медиаторах, иммуноглобулинах, в мононуклеарно-фагоцитарной системе, в факторах комплемента и др.). Оценку ИС проводят в два этапа. ^ выявляются обобщенные характеристики или грубые дефекты (ориентирующие тесты). К тестам первого уровня оценки Т-системы иммунитета (клеточного звена) можно отнести определение: - общего числа лимфоцитов (N-18-38%, при общем количестве лейкоцитов 4,5-9,5х109/л); - процентного и абсолютного числа зрелых ^ -лимфоцитов (СД3+), это фенотипическая характеристика иммунокомпетентных клеток с помощью моноклональных антител к соответствующим антигенам (N-50-76%, 800-1216/мкл); - двух основных субпопуляций - хелперов/индукторов (СД4+) и киллеров/супрессоров (СД8+). Применяется также тест розеткообразования с бараньими эритроцитами (Е-РОК) и определение Е-РОК активных (N-ЕРОКа-30-40%). ^ (гуморального звена) можно отнести определение: - процента и абсолютного количества В-лимфоцитов (СД20+, N-11-16%, 200-400/мкл) в тесте розеткообразования с эритроцитами мыши; - иммуноглобулинов классов G, A, M- в сыворотке крови (норма 8,0-16,0; 1,0-4,0; 0,6-1,9 г /л соответственно); - IgЕ (N-20-100 КЕ/л); - секреторного IgА - в слюне и бронхоальвеолярных смывах. К тестам первого уровня для оценки фагоцитоза можно отнести определение: - числа нейтрофилов (N-50-77%) и моноцитов (N-2-10%); - интенсивности поглощения микробов нейтрофилами и моноцитами (фагоцитарный показатель нейтрофильных гранулоцитов, N-48-88%); - бактерицидности - по тесту восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест, N-70-120 ед/млнклеток, N-10-20% формазанположительных нейтрофилов). На первом этапе определяются также циркулирующие иммунные комплексы -ЦИК (N 20-80 усл. ед.), уровень комплемента по 50%-ному гемолизу (N - 56-66 гемолитических единиц). ^ выявляют механизм поломок в иммунной системе, определенных на первом этапе. К тестам второго уровня для оценки Т-системы иммунитета (функциональная активность) можно отнести определение: - -интерферона; - фактора некроза опухоли (-ФНО); - содержание активационных молекул на поверхностной мембране ^ -лимфоцитов (СД 25+ - с рецепторами к ИЛ-2, N –13-24%, HLA- ДR); - пролиферативную активность на Т-митогены – ФГА и КонА в реакции бласттрансформации и на специфический антиген; - содержание цитокинов – ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6. На втором этапе проводят также кожные пробы с антигенами. ^ можно отнести определение: - субклассов иммуноглобулинов, особенно IgG; - секреторного IgA; - специфических антител; способности клеток к пролиферативному ответу на В-митогены (липополисахарид). Среди методов оценки фагоцитоза к тестам второго уровня можно отнести также определение хемотаксиса фагоцитов, экспрессии адгезии молекул на поверхностной мембране нейтрофилов. ^ и определение компонентов комплемента (С Iq, С3, С3а, С4, С5а, С1 ингибитора). Оценку иммунного статуса больного надо начинать, прежде всего с квалифицированной интерпретации клинического анализа крови. При этом следует обратить внимание на относительное и абсолютное содержание иммунокомпетентных клеток в 1 мкл периферической крови (для лимфоцитов – не ниже 1500-2000 клеток, нейтрофилов - не ниже 2000-2500, моноцитов – не менее 90). Если количество лимфоцитов снижено, необходимо перейти к обследованию больного по тестам первого уровня. Только когда отмечается несоответствие между клинической картиной и нормальными значениями тестов первого уровня или возникает необходимость назначить иммунорегуляторные препараты, нужно использовать тесты второго уровня. Нарушение иммунитета у больных туберкулезом В клинической картине туберкулеза доминируют нарушения Т-клеточного иммунитета. Таблица Нарушения иммунологической реактивности и их влияние на течение туберкулезного процесса
Изучение иммунного статуса и неспецифической реактивности больных туберкулезом показало, что при активном прогрессирующем распространенном процессе с распадом легочной ткани и бактериовыделением имеют место: депрессия Т-клеточного иммунитета, сдвиг соотношения СД4/СД8 в сторону уменьшения, повышение интенсивности продуцирования ИЛ I, ФНО-, ИЛ-6, подавление клеточного противотуберкулезного иммунитета, активация процесса продуцирования противотуберкулезных антител. При благоприятном течении туберкулеза, абациллировании, при закрытии полостей распада увеличивается соотношение СД4/СД8, снижается интенсивность продуцирования макрофагальных интерлейкинов и антител, увеличивается продуциролвание -ИНФ, при этом специфический клеточный иммунитет активируется. У больных остропрогрессирующими формами туберкулеза в развитии казеозного распада существенную роль может играть иммунодефицит. Для последнего характерны структурно-метаболические нарушения в иммунокомпетентных клетках и их апоптоз, ведущие к резкому снижению в крови количества Т-лимфоцитов, их регуляторных субпопуляций и снижение функциональной и синтетической способности Т-лимфоцитов. Одним из патогенетических механизмов прогрессирования данной формы туберкулеза являются также структурно-метаболические повреждения клеток моноцитарно-макрофагальной системы. Это ведет к резкому снижению их функции, жизнеспособности, быстрому разрушению в зоне поражения, в результате чего в легких формируются обширные казеозно-деструктивных изменения. При нарушениях Т-клеточного и специфического клеточного противотуберкулезного форм иммунитета повышается риск развития послеоперационных осложнений, существенно увеличивается число случаев перехода впервые выявленного инфильтративного туберкулеза в хронический фиброзно-кавернозный туберкулез. Супрессия иммунного ответа при туберкулезе представляет собой сложный процесс, в котором участвуют макрофаги и ^ -лимфоциты (вероятно, и В-лимфоциты, и иммунные комплексы), действующие в разных ситуациях на различные этапы иммуногенеза. В тех случаях, когда имеют место нарушения Т-клеточного иммунитета, введение иммунокорригирующих средств (Т-активина, левамизола, тимозина, диуцифона, ронколейкина, ликопида, рибомунила и др., действующих преимущественно на Т-клеточный иммунитет), восстанавливает нормальное функционирование Т-системы и вместе с тем оказывает положительное влияние на течение туберкулезной инфекции. ^ Современная диагностика туберкулеза, как и любого другого инфекционного заболевания, основывается на обнаружении в разных средах организма больного возбудителя болезни, в данном случае МБТ видов humanis или bovis (это - прямое доказательство заболевания туберкулезом) или специфических маркеров к возбудителю – антигенов либо антител. Однако бактериологическая диагностика при всех ее усовершенствованиях не дает больше 50% положительных результатов даже у бесспорно больных туберкулезом. Иммунодиагностика представляет собой самостоятельный раздел иммунологии, основной целью которого служит выявление изменений клеточного и гуморального звеньев иммунитета при инфицировании и заболевании туберкулезом с помощью соответствующих методов. «Прямым» методом иммунодиагностики туберкулеза выявляют антигены МБТ, причем как целые МБТ (иммунологическими методами), так и растворимые, например, циркулирующие в крови, антигены. Специфическим, но «не прямым», методом выявляют иммунный ответ организма человека на воздействие МБТ (как клеточный, так и гуморальный). С той же целью применяют так называемые туберкулино-провокационные тесты, подкожно вводят туберкулин и изучают различные показатели до и после провокации. Сама провокация - сугубо иммунологический фактор, так как ее результат может быть положительным только в сенсибилизированном организме. Определение состояния клеточного иммунитета с помощью клинических и функциональных тестов «само по себе» (без провокации) в дифференциально-диагностическом плане также используется в определенных ситуациях. Например, при округлых образованиях в легких: при туберкулезе депрессия Т-системы, как правило, выражена в меньшей степени, чем при новообразованиях; при аденопатиях внутригрудных лимфатических узлов и легочных диссеминациях важно учитывать более существенную депрессию Т-клеточного иммунитета у больных саркоидозом, чем туберкулезом. В то же время провокационные тесты мало подходят для массовой диагностики туберкулеза из-за технических сложностей и необходимости проведения повторного (через 48 и/ или 72 часа) исследования, что очень трудно осуществить при обследовании больших контингентов, тем более «здоровых» людей. При скрининговом обследовании взрослых сегодня можно использовать только ИФА (из методов микроанализа с автоматизированным учетом). При иммунодиагностике туберкулеза необходимо различать два ее основных аспекта: 1) скрининг населения с целью выявления лиц с подозрением на туберкулез для последующего их дообследования и 2) дифференциальную диагностику туберкулеза. Последнее является важной и сложной практической проблемой, во-первых, потому, что известен целый ряд заболеваний, клинико-рентгенологическая симптоматика которых сходна с таковой туберкулеза; во-вторых, вакцинация БЦЖ, а также инфицирование атипичными микобактериями и другими микроорганизмами, имеющими перекрестные антигены с МБТ, затрудняют интерпретацию ее результата. При скрининг-диагностике важнейшее значение имеет чувствительность метода, при дифференциальной диагностике главное – высокая специфичность метода. ^ Серологические реакции направлены на поиск специфических противотуберкулезных антител (ПТАТ). Они применяются с диагностической и дифференциально-диагностической целью. ^ : противотуберкулезные гемагглютинины, (АТ преимущественно класса Ig M), взаимодействуют с туберкулином, адсорбированным на эритроцитах барана или человека; в результате образуется комплекс «антиген - антитело», вследствие чего происходит агглютинация эритроцитов, что поддается визуальной оценке. При отсутствии АТ эритроцитов не склеиваются. Диагностический титр РНГА для взрослых > 1:8++, для детей >1:4++; РНГА чаще бывает положительной при процессах продуктивного характера. ^ (РПГ): выявляются гемолизины, АТ - преимущественно класса IgG, иногда - IgM. В результате реакции образуется комплекс антиген – антитело – комплемент, что обусловливает лизис эритроцитов-носителей, который оценивается колориметрически. Диагностический титр РПГ для взрослых - 8 у.е; для детей – 5 у.е. Гемолизины чаще обнаруживаются при деструктивных процессах. ^ (РПК): выявляются комплементсвязывающие АТ - главным образом IgG. РПК ставят в два этапа: на первом происходит фиксация комплемента, на втором (при добавлении гемолитической системы) – лизис и фиксация степени потребления комплемента на первом этапе. Диагностический уровень ПТАТ в РПК для взрослых 17 у.е.; для детей - 11 у.е. Полноценная диагностика туберкулеза основана на одновременной постановке и комплексном учете результатов всех трех реакций (РНГА+РПГ+РПК). Частота обнаружения с помощью данного комплекса специфических АТ варьирует в пределах от 30 до 80%, специфичность метода около 85 - 90%. ИФАСовременным и перспективным методом серодиагностики туберкулеза является твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Он применяется для выявления АГ МБТ и спектра АТ к ним. Обнаружение АТ к возбудителю туберкулеза в ИФА основано на их специфическом взаимодействии с иммобилизованным туберкулезным АГ. Показания к проведению ИФА: 1.Диагностика и дифференциальная диагностика туберкулеза (диагностика этиологии шаровидных, очаговых, инфильтративных и полостных образований легких). 2.Выявление скрытой активности туберкулеза. 3.Выявление реактивации туберкулеза у лиц с остаточными посттуберкулезными изменениями. 4.При скрининговом обследовании на туберкулез. 5.При обследовании лиц из группы риска по заболеванию туберкулезом, подвергшихся воздействию радиации. 6.Выявление этиологической значимости смешанной инфекции у больных туберкулезом (бактериальной, грибковой). Положительный результат ИФА означает, что в образце содержатся антитела к МБТ. Однако в ряде случаев могут иметь место ложно-положительные результаты из-за наличия общих антигенных детерминант у различных возбудителей. Отрицательный результат означает отсутствие в образце антител к МБТ. Если отрицательный результат получен при тестировании образца сыворотки больного с клиническими проявлениями туберкулеза, необходимо провести повторный анализ в динамике (через месяц). Отсутствие в сыворотке больных антител может объясняться нахождением их в составе циркулирующих иммунных комплексов. Положительные реакции сыворотки в ИФА при скрининговых исследования не являются основным показателем для постановки диагноза «туберкулез». Однако лица с положительной реакцией подлежат углубленному обследованию на туберкулез. ^ Бронхоальвеолярный смыв (БАС) является высокоинформативным материалом на основе клеточных элементов, иммунных, белковых, липидных и сурфактантных компонентов. Он использовался для изучения процессов, происходящих в легких при развитии заболевания, а также при дифференциальной диагностике болезней органов дыхания и определении их активности. Общее количество клеток в норме в БАС составляет 0,55 - 0,83х106 в/мл. Они представлены в основном альвеолярными макрофагами (85 - 98%), жизнеспособность которых составляет 63,6±5,6%. На долю лимфоцитов в БАС приходится 7 - 12%, нейтрофилов – около 1%. При туберкулезе легких значительно повышено содержание нейтрофилов; при саркоидозе характерен лимфоцитоз (чем активнее процесс, тем выше процентное содержание лимфоцитов), при неспецифических воспалительных заболеваниях - увеличение общего количества клеток в БАС и содержания нейтрофилов на фоне снижения уровня альвеолярных макрофагов до 20 - 40%; при экзогенном аллергическом альвеолите – значительное возрастание общего количества клеток, в том числе лимфоцитов. При исследовании бронхоальвеолярного смыва с целью диагностики, выявления нарушений и дисбаланса в местном иммунном ответе, а также дифференциальной диагностике туберкулеза проводят следующие тесты:
Иммунологические показатели БАЛ здоровых лиц: Т-лимфоциты 70 - 88%; Т-хелперы (СД4+) – 50%, Т-супрессоры (СД8+) 28 - 30%, соотношение Т-х/Т-с (СД4+/ СД8+)- 1/1,5-2; содержание Ig в среднем: IgA - 2 г/л; Ig,M - 0-8 г/л; Ig- 6 - 8 г/л, секреторного IgA, 2 - 2,5 г/л, ФН –60-80 нг/мг. При активном туберкулезе легких в БАЛ отмечаются снижение общего количества Т-лимфоцитов, СД4+, СД8+кл, уровня сывороточных иммуноглобулинов, в значительной мере - уровня секреторного IgA; выявляются специфические АТ к возбудителю туберкулеза. В процессе комплексной химиотерапии заметно нарастает содержание sIgA и ФН. При саркоидозе возрастает общее количество Т-лимфоцитов и Т-хелперов, причем при активном процессе соотношение Т-хелперов и Т-супрессоров увеличивается в 3-4 раза больше. Задания для самостоятельной работы студентов
ЛИТЕРАТУРАОсновная1. Перельман М.И., Корякин В.А. Фтизиатрия: Учебник для студентов медицинских вузов. – М.,1996. ДополнительнаяТуберкулез: Руководство для врачей / Под ред. А.Г. Хоменко. – М., 1996.
|
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка: 