«Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К. И скрябина» icon

«Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К. И скрябина»


2 чел. помогло.
Смотрите также:
Отчет о научно-исследовательской работе...
Отчет о научно-исследовательской работе...
Отчет о научно-исследовательской работе...
Отчет о научно-исследовательской работе...
Научно-образовательные рекомендации и указания егэ по общеобразовательным предметам Москва 2010...
Регламент Доклады на пленарном заседании 15 мин...
Программа круглого стола по итогам смотра-конкурса на лучшую научную работу среди аспирантов и...
Факультет зоотехнологий и агробизнеса (фзта)...
Чупикова наталия Игоревна Получение и биологическая характеристика мультипотентных мезенхимных...
Правила внутреннего распорядка для работников и обучающихся фгоу впо мгавмиБ...
Воспроизводство и выращивание тиляпии в водоемах с разными экологическими условиями...
Совет молодых ученых и специалистов материалы круглого стола «Молодые ученые России и Зарубежья...



Загрузка...
скачать


На правах рукописи


Чиркова

Ирина Владимировна


Биологические свойства бактериофагов

к Salmonella typhimurium и их применение

в борьбе с сальмонеллезом гоубей


16.00.03 – Ветеринарная микробиология, вирусология,

эпизоотология, микология с микотоксикологией

и иммунология


Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Москва 2008

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И Скрябина» (ФГОУ ВПО МГАВМиБ).


^ Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Пименов Николай Васильевич.


Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ

^ Бессарабов Борис Филиппович;

кандидат ветеринарных наук

Капустин Андрей Владимирович


Ведущая организация: Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко» (ГНУ ВИЭВ).


Защита диссертации состоится «24» октября 2008 г. в «14.00» часов на заседании диссертационного совета Д 220.042.01 при Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» по адресу: 109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23; тел. (495) 377-93-83.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО МГАВМиБ.


Автореферат разослан « 23» сентября 2008 г.


Ученый секретарь

диссертационного совета,

профессор Т.Н. Грязнева


^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность темы. Становится все более распространенным разведение голу­бей. Среди бактериальных инфекций голубей сальмонеллез занимает одно из веду­щих мест (Гусев В.В., 2005). Основной серовариант, вызывающий эпизоотический процесс на голубятнях относится к серогруппе В – Salmonella typhimurium (Geor­giades G.K., 2002 г). Кроме того, S. typhimurium – основной возбудитель сальмонел­леза уток, гусей (80-90%) (Осидзе Д.Ф, 1987), и один из основных сероваров, вызы­вающих пищевые токсикоинфекции человека (Гусев В.В, 2005).

Борьба с сальмонеллезом голубей актуальна для обеспечения санитарного бла­гополучия и профилактики пищевых токсикоинфекций человека, для лечения и профилактики сальмонеллеза клубных голубей, для профилактики сальмонеллеза в промышленном птицеводстве и животноводстве.

Применение специфических и литически высокоактивных бактериофагов для борьбы с сальмонеллезом голубей позволит санировать птицу от сальмонеллоноси­тельства, обеспечить защиту от заболевания с первых дней жизни, предотвратить поствакцинальные осложнения и повысить сохранность поголовья, ограничив при­менение антибиотиков.

^ Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований являлось выде­ление и изучение основных биологических свойств бактериофагов к S. typhimurium, а также создание и определение эффективности применения фагового препарата для борьбы с сальмонеллезом голубей.

Для осуществления данной цели были поставлены задачи:

1. Изучить эпизоотическую ситуацию по сальмонеллезу голубей в Московском регионе.

2. Выделить и селекционировать высокоактивные бактериофаги к Salmonella ty­phimurium.

3. Изучить морфологию, литическую активность, специфичность и спектр лити­ческого действия селекционированных фагов тифимуриум.

4. Создать фаговый препарат, изучить его профилактическую и лечебную эф­фективность для голубей в лабораторных условиях.

5. Изучить эффективность применения экспериментальных серий препарата в неблагополучных по сальмонеллезу голубятнях и вольерах.

^ Научная новизна. Изучена эпизоотическая ситуация по сальмонеллезу голубей в г. Москве и Подмосковье. Выделены бактериофаги к S. typhimurium, селекциони­рованы наиболее активные из них и изучены их биологические свойства. Создан биологический препарат Бактериофаг тифимуриум, предназначенный для лечения и профилактики сальмонеллеза голубей, изучена его профилактическая и лечебная эффективность в лабораторных и практических условиях. Терапевтическая эффек­тивность препарата составила 100%.

^ Практическая ценность работы. Рекомендован для внедрения в биологиче­скую промышленность и ветеринарную практику Бактериофаг тифимуриум против сальмонеллеза голубей с установленной эффективностью.

Разработаны и внедрены «Рекомендации по диагностике, профилактике и лик­видации сальмонеллеза голубей».

Бактериофаги к Salmonella typhimurium депонированы в ФГУ ВГНКИ.

^ Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Открытой Всероссийской научно-практической конференции «Молодежь и наука ХХI века» (Ульяновск, 24-26.04.2007); на Всероссийском конкурсе на лучшую научную работу среди аспирантов и молодых ученых вузов МСХ РФ (г. Воронеж и г. Москва, 2007); Х Всероссийской медико-биол. конференции «Человек и его здоровье» (Санкт-Пе­тербург, 20-21.04.2007), на Всероссийском конкурсе «Развитие АПК РФ» (Москва, 27-29.05.2008), межкафедральных заседаниях ФГОУ ВПО МГАВМиБ.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликованы 6 научных статей и методические рекомендации, одобренные Департаментом ветеринарии Минсель­хоза РФ от 11.04.2008 № 25-25/16.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собст­венных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, сведений о практическом использовании результатов исследований, рекомендаций по исполь­зованию научных выводов, приложений. Список использованной литературы вклю­чает 185 источников, из них 43 – зарубежных авторов. Работа содержит 18 таблиц и 15 рисунков.

^ Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Эпизоотическая ситуация по сальмонеллезу голубей в Москве и Московской области.

2. Биологические свойства выделенных и селекционированных бактериофагов к S.typhimurium.

3. Протективные и лечебные свойства препарата Бактериофаг тифимуриум про­тив сальмонеллеза голубей.


^ СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ


Материалы и методы


Работа выполнена в 2005-2008 г. в основном объеме на базе кафедры клиниче­ской диагностики и болезней молодняка ФГОУ ВПО МГАВМиБ.

Белые мыши массой 14-16 г – 320 голов, голуби различных пород, фазаны, ле­беди, утки и другая птица – 1245 голов, штаммы и изоляты S. typhimurium, S. enteri­tidis, S. gallinarum-pullorum, S. dublin, S. newlands и другие культуры микроорганиз­мов, питательные среды, О-; О- и H- агглютинирующие сальмонеллезные сыворотки, электронный микроскоп JEoL-100 S, ДНК-амплификатор «Терцик», центрифуги, ав­томатические пипетки-дозаторы, бактериальные фильтры, водяная баня, термостат, микроскопы, лабораторная посуда и другие.

Бактериологическое исследование проводили согласно «Методическим указа­ниям по лабораторной диагностике сальмонеллезов животных и человека», утвер­жденным Департаментом ветеринарии РФ и Госкомсанэпиднадзором Минздрава РФ 18.06.96.

Полимеразно-цепную реакцию (ПЦР) проводили на базе ФГУ ВГНКИ, исполь­зуя тест-системы НИИ эпидемиологии.

Выделение изолятов бактериофагов сальмонелл проводили из фекальных вод голубятен, используя метод обогащения, описанный Адамсом (1961). Изучение био­логических и морфологических свойств фагов проводили методами, описанными А.С. Тихоненко (1968), В.Я. Ганюшкиным (1988), А.П. Пономаревым (2002). Статистиче­скую обработку полученных цифровых данных проводили по Н.А. Плохинскому в соответствии с методами, описанными в работах П.И. Ашмарина и А.А. Воробьева.


^ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ


Эпизоотическая ситуация по сальмонеллезу голубей


По результатам исследования патологического материала за 2004-2007 гг. в ФГУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория» число S.typhimurium среди случаев выделения сальмонелл других серовариантов от птиц в 2004 г. составило 6,2%, 2005 г. – 38,0%, 2006 г – 7,1%, в 2007 г. – 6,6%. От голубей в ФГУ ЦНМВЛ выделение S. typhimurium отмечали в период 2003-2007 гг. в среднем в 85,19% случаев.

При исследовании нами патологического материала от диких и синантропных птиц, декоративных голубей г. Москвы, Подмосковья за период 2004-2008 гг. поло­жительные результаты на сальмонеллез отмечены в 97 из 123 анализов – 78,9%. S.typhimurium была выделена нами в 96%, S. enteritidis – в 1,6% случаях, в осталь­ных случаях – другие виды сальмонелл.


^ Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов к S.typhimurium


По методу обогащения Адамса нами были исследованы пробы пометных вод и фекалий голубей, выделены 10 бактериофагов к S. typhimurium, из которых три: №5 ТЗ, № 8 МЁ, № 9 ММ – с наиболее высокой степенью литической активности.

Литическая активность фагов к эталонному штамму S.typhimurium М-2ф t-ДЕП, составила: по методу Аппельмана 10-10, 10-8 и 10-10; по Грациа 3,6×108 БОЕ/см3, 1,0×107 БОЕ/см3, 1,4×108 БОЕ/см3 соответственно.

Для получения чистых колоний фагов морфологически однотипные негативные колонии клонировали 7 раз и из 10-кратных разведений фаголизата суспензии высе­вали по методу Грациа. Бактериофаги №5 ТЗ, №9 ММ формировали на бактериальном газоне круглые, прозрачные с ровными краями колонии диаметром 1,5-2,5 мм, № 8 МЁ – крупные, прозрачные колонии диаметром 2,5-3,5 мм со вторичным ростом ин­дикаторной культуры.

Исследованный спектр литической активности и диапазон специфичности фагов с музейными и полевыми культурами микро­организмов представлен в таблице 1.


^ 1. Диапазон специфичности бактериофагов №5 ТЗ, №8 МЁ, №9 ММ

Микроорганизмы

Бактериофаги

5 ТЗ

8 МЁ

9 ММ

S. typhimurium

S. gallinarum-pullorum

S. enteritidis

S. dublin

S. newlands

Escherichia coli

Klebsiella pneumoniae

Yersinia pseudotuberculesis

Proteus vulgaris

Proteus mirabilis

Pasteurella multocida

Bordetella bronchiseptica

Listeria monocytogenes

29/32

5/7

8/10

3/4

1/3

0/7

0/3

0/2

0/2

0/3

0/2

0/2

0/2

28/32

6/7

9/10

4/4

2/3

0/7

0/3

0/2

0/2

0/3

0/2

0/2

0/2

26/32

6/7

8/10

3/4

2/3

0/7

0/3

0/2

0/2

0/3

0/2

0/2

0/2

Примечание: в числителе – количество лизируемых культур бактерий; в знаменателе – ко­личество всех тестируемых штаммов.

Как видно из таблицы 1, селекционированные фаги показали широкий спектр литического действия: Phagum S. typhimurium №5 ТЗ лизировал 29 из 32, Ph. S. ty­phimurium №8 МЁ – 28 из 32, Ph. S. typhimurium №9 ММ – 26 из 32 изолятов S. ty­phimurium, кроме того, лизировали S. enteritidis (из 10 штаммов – 80-90%), S. gallina­rum-pullorum (из 7 – 75-100%), S. dublin (из 4 – 85-100%), S. newlands (из 3 – 33-67%), но не лизировали бактерии других родов семейства Enterobacteriaceae и дру­гих семейств, что подтверждает специфичность их действия.

Изучение морфологии отобранных бактериофагов проводили при помощи элек­тронно-микроскопических исследований на электронном микроскопе JEoL-100 S при ускоряющем напряжении 80 кВ с использованием метода негативного контра­стирования с 2%-ным водным раствором уранил-ацетата в ГУ НИИ вирусологии имени Д.И. Ивановского РАМН при инструментальном увеличении в 53018 раз и фотографическом в 25-80 раз. Получены электронные фотографии фагов (рис. 1).








а

б

в

Рис.1. ^ Бактериофаги Phagum S. typhimurium (а - №5 ТЗ, б - №8 МЁ, в - №9 ММ)



По А.С. Тихоненко (1968) все три бактериофага были отнесены к IV классифи­кационной группе. Это фаги с длинным, несокращающимся отростком с периодиче­ской исчерченностью и изометрическими головками, содержащими внутри двутя­жевую ДНК, входят в семейство Siphoviridae, относятся к морфотипу В1. Основные размеры структурных элементов вирионов фагов Ph. S. typhimurium 5 ТЗ, 8 МЁ, 9 ММ представлены в таблице 2.


^ 2. Размеры структурных элементов вирионов фагов, нм


Изолят бакте­риофага

Диаметр

головки, нм

Диаметр

хвостового отростка, нм

Ширина хво­стового

отростка, нм

Морфотип фага

№ 5 ТЗ

№8 МЁ

№9 ММ

50

64

37

225

120

117

11

11

10

В1

В1

В1


Как видно из таблицы 2, выделенные бактериофаги имеют сходную морфоло­гию, размер головки от 50 до 100 нм. Фаг № 9ММ имеет диаметр головки 37 нм, но по остальным морфологическим свойствам сходен с бактериофагами № 5 ТЗ и № 8 МЁ.


^ Изготовление препарата Бактериофаг тифимуриум


Три высокоактивных бактериофага были депонированы в ФГУ ВГНКИ как Pha­gum Salmonella typhimurium №5 ТЗ – ДЕП, Phagum Salmonella typhimurium №8 МЁ – ДЕП, Phagum Salmonella typhimurium №9 ММ – ДЕП. На их основе приготовлен препарат для профилактики и лечения сальмонеллеза голубей с содержанием 108 фаговых частиц в 1 см3, консервированный 0,01% раствором хинозола (рис. 2).

_s1029

_s1035


_s1030_s1030_s1030


_s1029_s1029





Рис 2. ^ Схема изготовления препарата Бактериофаг тифимуриум


Готовый препарат – Бактериофаг тифимуриум против сальмонелллеза голубей проверяли на стерильность высевом на МПА и в МПБ, а также на активность, для чего белым мышам массой 14-16 г (10 голов) подкожно вводили S. typhimurium М-2ф t в дозе 10 тыс. мкр. кл. (5LD50) и, спустя 20 минут, – препарат в дозе 0,5 см3. Контрольной группе лабораторных мышей вводили только культуру сальмонеллы в указанных дозах. Наблюдали 14 дней – в опытной группе сохранность составила 100%, тогда как в контрольной группе все 10 мышей пали, из их паренхиматозных органов была выделена S. typhimurium.

Таким образом, было установлено, что изготовленный препарат Бактериофаг тифимуриум активен и безопасен для белых мышей.


^ Экспериментальная инфекция сальмонеллеза голубей


Экспериментальную инфекцию сальмонеллеза голубей вызывали путем ораль­ного заражения невакцинированных голубей породы синий 3-месячного возраста. Всего было использовано 4 группы по 4 голубя на каждый тестируемый штамм S. typhimurium М-5в t, М-2ф t, Д-1в t из коллекции кафедры. Наблюдение за птицей вели в течение 14 дней после инфицирования, учитывали количество заболевших и павших.

Больная птица хохлилась, отмечали повышение температуры до 43,0-43,5С, слабость, угнетение, одышку, анорексию, атаксию, диарею с содержанием слизи и желчи, в некоторых случаях – ринит и др. Гибель отмечали преимущественно на 5-10 сутки после инфицирования. При вскрытии наблюдали катаральное воспаление слизистой оболочки кишечника, незначительное увеличение селезенки, некротиче­ские узелки на печени.

Значения LD50 составили для S. typhimurium М-5в t = 2,025 млн мкр. кл.; S. typhimurium М-2ф t = 2,8856 млн мкр. кл.; S. typhimurium Д-1в t = 3,135 млн мкр. кл.


^ Определение эффективности бактериофагового препарата в остром

лабораторном опыте при сальмонеллезе голубей


Для определения профилактического действия Бактериофага тифимуриум голу­бям первой опытной группы (10 голубей 3-месячного возраста породы синий) орально вводили препарат из расчета 0,5 см3 индивидуально автоматической пипет­кой-дозатором. Через 12 часов проводили заражение голубей смесью штаммов S. typhimurium М-5в t, S. typhimurium М-2ф t, S. typhimurium Д-1в t по 0,7 мл, в кон­центрации 5 млн мкр. кл. в 1 мл, т.е. общая инфицирующая доза составила 10,5 млн мкр. кл. (4 LD50).

Голубям второй опытной группы бактериофаг выпаивали согласно разработан­ному временному наставлению. Необходимое для обработки поголовья птиц количе­ство доз препарата добавляли в питьевую, предварительно кипяченую и охлажденную до 20-30ºС воду, из расчета 10-20 мл на голубя на одно выпаивание. За три часа до выпойки Бактериофага тифимуриум голубей выдерживали без поения. Заражение птиц проводили через 12 часов аналогично первой группе. Птиц контрольной группы инфицировали смесью штаммов в тех же дозах, но обработку бактериофагом не про­водили.

Наблюдение вели 15 дней, после чего проводили убой и бактериологическое ис­следование трупов павших и убитых голубей. В результате проведенных лаборатор­ных испытаний отмечены профилактические свойства 90-100% при 10% сохранно­сти в контрольной группе (табл. 3).


^ 3. Профилактическая эффективность применения Бактериофага тифимуриум


Группа

Количе­ство го­лубей,

голов

Забо­лело,

голов

Пало,

голов

Леталь­ность, %

Выделение

S. typhimurium

от голубей

голов

%

1-опытная

10

0

0

0

0

0

2-опытная

10

1

1

10

1

10

Контрольная

10

9

9

90

10

100



Примечание: Р<0,05


Определение терапевтического действия Бактериофага тифимуриум проводили на 30 голубях породы синий 3-месячного возраста. Были созданы три группы: две опытные (по 10 голубей) и контрольная (10 голубей), которых кормили и содержали по принципу аналогов. Голубей всех групп инфицировали смесью: S. typhimurium М-5в t, S. typhimurium М-2ф t, S. typhimurium Д-1в t аналогично предыдущему опыту, затем через 12 часов голубям первой опытной группы орально вводили бак­териофаг из расчета 0,5 см3 препарата индивидуально. Голубям второй опытной группы бактериофаг выпаивали через 12 часов после инфицирования, добавляя его в питьевую воду. Голубей контрольной группы Бактериофагом тифимуриум не обра­батывали. Наблюдение вели 14 дней, после чего проводили убой и бактериологиче­ское исследование трупов (табл. 4).


^ 4. Терапевтическая эффективность Бактериофага тифимуриум

в лабораторных условиях


Группа

Количе­ство голу­бей,

голов

Забо­лело,

голов

Пало,

голов


Леталь­ность, %

Выделение

S. typhimurium

от голубей

голов

%

1-опытная

10

0

0

0

0

0

2-опытная

10

0

0

0

0

0

Контрольная

10

7

7

70

10

100



Примечание: Р<0,05


Из представленных в табл. 4 данных видно, что Бактериофаг тифимуриум обла­дает выраженными лечебными свойствами. У голубей, которым был выпоен бакте­риофаг, не было клинических проявлений сальмонеллеза. Через 14 дней при убое и бактериологическом исследовании в опытных группах сальмонелл не выделяли.

Таким образом, Бактериофаг тифимуриум обладает выраженной литической ак­тивностью против сальмонелл in vivo. Профилактическая эффективность препарата составила 90-100%, а терапевтическая – 100% при заражении голубей вирулент­ными штаммами S. typhimurium в лабораторных условиях.


^ Определение терапевтической эффективности препарата

Бактериофаг тифимуриум в производственных условиях


Производственные испытания терапевтической эффективности Бактериофага тифимуриум были проведены на пяти голубятнях, расположенных в различных районах г. Москвы и Московской области.

Болезнь сопровождалась характерными клиническими признаками, острым, под-острым и хроническим течением. Диагноз был подтвержден бактериологическими исследованиями и методом молекулярной диагностики в ПЦР.

Обработку голубей Бактериофагом тифимуриум проводили трижды с интерва-лом 48 часов в дозе 0,5 см3 на голубя групповым методом с питьевой водой в раз-ведении 1:20.

На третьи сутки после начала фаготерапии состояние большинства заболевшей птицы улучшилось, появилась активность, восстановился аппетит, консистенция и цвет помета нормализовались, прекратились новые случаи заболевания и гибель птицы. При контрольных исследованиях положительных результатов на сальмонел-лез не отмечали. За период наблюдения (6 месяцев) рецидивов сальмонеллеза на голубятнях не регистрировали.


^ 5. Терапевтическая эффективность Бактериофага тифимуриум

в условиях голубятен


Местоположение голубятни


Марьино,

г. Москва


Кузьминки,

г. Москва


г. Подольск, Моск. обл.


г.Домоде-дово,

Моск. обл.

Бирюлево,

г. Москва


1

2

3

4

5

6

Количество голубей, голов

162

76

295

150

75

Заболаевемость, %

69,1

13,6

15,2

58,0

14,7

Летальность, %

20,5

20,0

2,2

89,6

36,4

Период клинического оздоровления, дней

6

9

8

6

5

1

2

3

4

5

6

Падеж с начала лечения, гол

0

0

0

0

0

Бактериологический анализ через 14 сут. (смывы из клоаки)


сальмонелл не выделили


ПЦР через 30 суток:
















- количество проб

20

20

20

20

20

- получено положительных результатов

0

0

0

0

0


По результатам проведенных опытов показано, что при лечении сальмонеллеза в условиях голубятен Бактериофаг тифимуриум обладает 100% терапевтической эф­фективностью (табл. 5).


^ Экономическая эффективность полученных результатов лечения


Предотвращенный ущерб при лечении сальмонеллеза в среднем на 100 голубей составляет (при коэффициенте летальности 0,3; средней стоимости 1 голубя – 500 руб. и 90%-ной эффективности терапии) 10000 руб.

Один рубль вложенных средств позволяет получить экономический эффект в размере 16,67 руб. при условии, что цена одной дозы препарата составляет 2 рубля.


^ Изучение лечебного действия бактериофагового препарата в опыте

на других видах птиц


Терапевтическая эффективность препарата была исследована в передвижном частном зоопарке «Ташир» и в зоопитомнике ФГУ «Московский зоологический парк».

В частном передвижном зоопарке «Ташир» в ноябре 2005 г. наблюдали заболе-ваемость уток, фазанов и других птиц сальмонеллезом, при этом у взрослой птицы отмечали матовое оперение, взъерошенный вид, апатию, периодически жидкий помет с зелеными прожилками, отставание в росте, повышение температуры тела, понижение аппетита.

Из 28 фазанов разных пород клиническую картину заболевания наблюдали у 6 (21%). 2 фазана 3-месячного возраста пали. При вскрытии павшей птицы обнаруживали катаральное воспаление слизистой оболочки кишечника, слизь на поверхности кишечника, мелкие кровоизлияния, очажки некроза в печени, на селезенке и другие изменения. S. typhimurium выделяли в смывах из клоаки у всех фазанов. У 9 уток породы кряква отмечалась острая инфекция с развивитием угнетения, анорексии, повышения температуры до 43,5-44,0ºС, диареи. 5 уток из 9 пали. Утки положительно реагировали в ПЦР на сальмонеллез, из клоаки выделена сальмонелла.

Выпойку Бактериофага тифимуриум проводили групповым способом (1:20 с водой) всей птице зоопарка из расчета: перепелам – по 0,5 см3 препарата, фазанам, уткам – по 1 см3, селезням, павлинам – по 3 см3, гусям, лебедям – по 5 см3 трижды с интервалом 12 часов, четвертую и пятую выпойки – через 48 часов.

На третьи сутки после начала фаготерапии состояние заболевших улучшилось, восстановился аппетит, оформился помет, температура к 5-6 дню лечения нормализовалась. Гибель птицы больше не отмечали, при бактериологическом анализе смывов из клоаки у фазанов и уток, проведенном через 14 суток, бактерий рода Salmonella не выделяли. ПЦР через месяц после начала фаготерапии не дала положительных результатов.

В зоопитомнике Московского зоопарка наблюдали случаи заболевания голубей, уток, гусей и других птиц. В вольерах содержались 65 голубей, 30 гусей, 42 утки, 22 лебедя, 4 фазана, 1 павлин.

Клинически заболевание отмечали у 12 голубей (18,5%) породы гривуны, свердловские и др. в возрасте от 2 мес. до 2 лет. Заболевание характеризовалось типичными для сальмонеллеза клиническими признаками, у трех голубей отмечали неспособность к полету, опухание локтевых и коленных суставов. 8 голубей в возрасте от 2 до 8 мес. пали (смертность составила 12%). У уток отмечали схожие признаки, наиболее выраженные у утят 2-х месяцев. Пали 3 утенка из 8. У 1 золотистого фазана отмечали развитие угнетения, понижение аппетита, жидкий помет. У гусей, содержавшихся в соседнем вольере, и у лебедей не отмечали клинических признаков заболеваний, однако из помета выделяли S. typhimurium.

Выпойку препарата проводили орально всей птице зоопарка. Лечение Бактериофагом тифимуриум показало высокую эффективность, выздоровление птиц к 4-6 суткам, отсутствие сальмонеллоносительства по результатам контрольных исследований на 10 день после начала лечения.

Таким образом, терапевтическая эффективность препарата Бактериофаг тифимуриум на птицах частного зоопарка «Ташир» и зоопитомника ФГУ «Московский зоологический парк» составила 100%.


^ Исследование возможности возникновения резистентности сальмонелл к бактериофагам


Инфицирование голубей S. typhimurium М-5в t орально в дозе 4 млн мкр. кл с однократной выпойкой Ph. S. typhimurium №9 ММ в дозе 0,5 см3 через 2 часа четырехкратно с интервалом 10 месяцев показало отсутствие возникновения фагорезистентности у сальмонеллы. Клинических признаков сальмонеллеза отмечено не было, в то время как у голубей контрольной группы без обработки фагом на второй день после заражения наблюдались признаки, характерные для сальмонеллеза: диарея с примесью слизи, вялость, взъерошенность, отказ от корма и гибель на 5-10 сутки.

Каждые 2 месяца проводили опыт, где на три чашки Петри высевали штаммы S. typhimurium Д-1в t, М-2ф t, M-5в t. Чашки делили на три сектора, в которые вносили по капле фагов: Ph. S. typhimurium №5 ТЗ – ДЕП, №8 МЁ – ДЕП, №9 ММ – ДЕП. Через сутки инкубирования проводили учет реакции по образованию зоны негативного роста, после чего культуры сальмонелл с каждого сектора агара вблизи границы с зоной негативного роста фага высевали в полужидкий агар и после инкубации помещали на хранение при температуре 4С. По истечению двух месяцев проводили аналогичный опыт – на отдельные чашки высевали штаммы сальмонелл, хранившиеся в полужидком агаре и восстановленные при 8-12-часовом росте на МПБ. На каждую чашку Петри с высеянным штаммом сальмонелл капали те же фаги, что и в предыдущий раз. Данный опыт повторяли 8 раз с интервалом 60 суток. Активность фагов на изоляты сальмонелл оставалась неизменной – на каждый посев в течение 30 месяцев возникали очаги лизиса культуры бактерий примерно одинаковые по размеру. Изменений в структуре колоний и биологических свойствах S. typhimurium за время проведений опытов выявлено не было.

Таким образом, при проведении опытов по возможности возникновения резистентности сальмонелл к фагам появления фагоустойчивых изолятов сальмонелл выявлено не было.


^ Выделение и селекция резервных бактериофагов для препарата

Бактериофаг тифимуриум


На длительную перспективу применения препарата нами были продолжены вы­деление, селекция и изучение биологических свойств бактериофагов к S. typhi­murium. По методу обогащения выделили дополнительно 29 бактериофагов, из них 13 – с активностью от 10-8 до 10-10 и 2 – с активностью 10-5 до 10-7 (табл. 6).


^ 6. Свойства резервных фагов


Назва­ние фага

Морфология негативных колоний

Литическая активность по методу

форма

цвет

диаметр, мм

Аппель­мана

Грациа,

БОЕ/см3

11 ФЧ

круглые

прозрачные

5,0-8,0

10-10

3,2×108

12 Ф1Т

круглые

прозрачные

0,5-1,0

10-8

1,7×108

13 ВГ

круглые

прозрачные

2,0-3,0

10-10

2,5×108

14 ПП

круглые

прозрачные

2,0-3,0

10-9

3,0×108

15 СС

круглые

прозрачные

2,5-3,0

10-10

4,0×1010

16 ФЗ

круглые

прозрачные

2,0-3,0

10-9

5,0×107

17 Ф2 М

круглые

прозрачные

1,0-2,5

10-5

1,7×104

18 ГО

круглые

прозрачные

5,0-6,0

10-9

2,7×107

19 БЕ

круглые

прозрачные

1,0-2,0

10-5

1,7×104

20 Н2Ж

крупные, круглые

полупрозрачные, с вторичным ростом

2,5-5,0

10-8

5,5×107

21 БИ

круглые

прозрачные

7,0-9,0

10-8

1,2×107

22 ПР

круглые

прозрачные

2,5-3,0

10-8

5,6×108

23 ТУ

круглые

прозрачные

1,5-2,5

10-10

1,2×109

24 Ф2В

круглые

прозрачные

1,5-2,5

10-8

6,8×107

25 ПО

круглые

прозрачные

1,0-2,0

10-6

3,1×105


Изучением специфичности и спектра литического действия наиболее высокоактив­ных фагов был отмечен лизис S. typhimurium (из 20 музейных и полевых культур – более 90-100%), S. dublin (из 4 культур – 85-100%), S. enteritidis (из 15 – 80-90%), S. gallinarum-pullorum (из 7 – 75-100%), S. newlands (из 3 – 20-60%) и отсутствие лити­ческого действия на штаммы других энтеробактерий.

Структуры вирионов наиболее литически высокоактивных резервных бактерио­фагов характеризовали по электронно-фотографическим изображениям (табл. 7).


^ 7. Размеры структурных элементов вириона, нм



Изолят бак­териофага

Диаметр головки, нм

Длина хвостового отростка, нм

Ширина хвостового отростка, нм

Морфотип фага

11 ФЧ

53

230

5

В1

13 ВГ

68

133

3

В1

14 ПП

60

280

6

В1

15 СС

62

237

5

В1

16 ФЗ

50

150

5

В1

18 ГО

63

233

5

В1


Данные исследования позволили фаги Ph. S. typhimurium 11 ФЧ, 13 ВГ, 14 ПП, 15 СС, 16 ФЗ, 18 ГО отнести к IV классификационной группе по А.С. Тихоненко, семейству Siphoviridae и паспортизировать.


ВЫВОДЫ


1. Сальмонеллез – широко распространенное бактериальное заболевание голу­бей. Серовариант Salmonella typhimurium является основным возбудителем сальмо­неллеза голубей (96%).

2. Выделенные нами бактериофаги Phagum Salmonella typhimurium №5 ТЗ, Ph. S. typhimurium №8 МЁ и Ph. S. typhimurium №9 ММ являются высокоактивными (актив­ность по методу Аппельмана составила 10-10, 10-8 и 10-10, по Грациа – 3,6×108 БОЕ/см3; 1,0×107 БОЕ/см3; 1,4×108 БОЕ/см3 соответственно), специфичными и обладают широ­ким спектром литического действия по отношению к возбудителям сальмонеллеза голубей.

3. Фаги Ph. S. typhimurium №5 ТЗ, №8 МЁ, №9 ММ по строению относятся к IV группе по А.С.Тихоненко, семейству Siphoviridae и морфотипу В1.

4. Бактериофаги Phagum Salmonella typhimurium №5 ТЗ – ДЕП, Ph. S. typhi­murium №8 МЁ – ДЕП, Ph. S. typhimurium №9 ММ – ДЕП депонированны в ФГУ ВГНКИ. На их основе изготовлен препарат Бактериофаг тифимуриум для профи­лактики и лечения сальмонеллеза голубей. Препарат безвреден и высокоактивен в подкожном тесте на белых мышах.

5. В лабораторных условиях протективная эффективность препарата Бактерио­фаг тифимуриум против сальмонеллеза голубей составила 90-100%, терапевтиче­ская эффективность – 100% при гибели в контрольных группах 70-100% инфициро­ванных голубей.

6. Бактериофаг тифимуриум эффективен в условиях голубятен. На 5 неблагопо­лучных по сальмонеллезу голубятнях г. Москвы и Московской области лечение Бактериофагом тифимуриум позволило ликвидировать инфекционный процесс и сальмонеллоносительство: контрольные исследования на 14-е сутки после примене­ния препарата бактериологическими методами и на 30-е сутки в ПЦР – отрица­тельны.

7. Экономическая эффективность лечения сальмонеллеза у голубей Бактериофагом тифимуриум составила 16,67 руб. на 1 руб. затрат.

8. Терапевтическая эффективность Бактериофага тифимуриум была отмечена на птицах различных видов зоопитомника ФГУ «Московский зоологический парк» (голуби, утки, фазаны) и вольеров передвижного зоопарка «Ташир» (утки, фазаны) и составила 100%.

9. Применение фагов, включенных в препарат Бактериофаг тифимуриум, в тече­ние 30 месяцев не вызывает потери или снижения фагочувствительности у сальмо­нелл в опытах на питательных средах и на голубях.

10. Дополнительно выделены и селекционированы 15 резервных фагов с актив­ностью 10-5-10-10 и широким спектром литического действия в отношении S. typhimurium, а также S. dublin, S. enteritidis, S. gallinarum-pullorum, S. newlands. Электронная микроскопия Ph. S. typhimurium 11 ФЧ, 13 ВГ, 14 ПП, 15 СС, 16 ФЗ, 18 ГО из числа резервных позволила отнести их к IV классификационной группе по методике А.С. Тихоненко, семейству Siphoviridae и морфотипу В1.


^ СВЕДЕНИЯ О ПРАКТИЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ

РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ


Научные данные, полученные в ходе работы, использованы для составления «Рекомендаций по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза голу­бей», одобренных Департаментом ветеринарии МСХ РФ (№ 25-25/162 от 11.04.2008).

Результаты, полученные при изучении эффективности Бактериофага тифиму­риум, внедрены в ветеринарную практику голубятен и зоопарков России. Мате­риалы научных исследований используются в учебном процессе в ФГУ ВПО МГАВМиБ.

Выделенные бактериофаги Phagum Salmonella typhimurium №5 ТЗ – ДЕП, Ph. S. typhimurium №8 МЁ – ДЕП, Ph. S. typhimurium №9 ММ – ДЕП депонированы в ФГУ ВГНКИ в качестве производственных.

Получено уведомление о положительном результате формальной экспертизы по заявленному патенту на препарат против сальмонеллеза голубей и способ лечения сальмонеллеза голубей.


^ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ


Изученные особенности сальмонеллеза голубей при экспериментальном инфи­цировании, эффективность применения Бактериофага тифимуриум рекомендуется учитывать при планировании противоэпизоотических мероприятий при сальмонел­лезе голубей.

Препарат Бактериофаг тифимуриум рекомендован специалистам и владельцам голубятен для профилактики и лечения сальмонеллеза птиц.


^ СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ

ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ


1. Пименов Н.В. Биологические свойства бактериофагов Salmonella typhimurium и их терапевтическая эффективность против сальмонеллеза голубей /Н.В.Пименов, И.В. Чиркова // Молодежь и наука ХХI века: Сб. науч. тр. – Ульяновск: УГСХА, 2007. – С. 336-340.

2. Пименов Н.В. Фаговыделение, терапия и профилактика сальмонеллеза голубей /Н.В. Пименов, И.В. Чиркова // Ветеринария. – 2007. – №10. – С. 24-27.

3. Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза го­лубей / Н.В. Пименов, А.Н. Куриленко, И.В. Чиркова, С.С. Яковлев. – М: МСХ РФ. – Изд. «МегАрт». – 2008 – 43 с.

4. Чиркова И.В. Биологические свойства бактериофагов против сальмонелл ти­фимуриум и их использование в борьбе с сальмонеллезом птиц / И.В. Чиркова, Н.В. Пименов //Ветеринария и кормление. – 2008. – №3. – С. 32-33.

5. Чиркова И.В. Применение бактериофагов для лечения сальмонеллеза голубей с целью снижения заболеваемости сальмонеллезом человека /И.В. Чиркова // Фун­даментальная наука и клиническая медицина: Человек и его здоровье: Сб. науч. тр. – СПб, 2007. – С. 510-511.

6. Чиркова И.В. Специфическая профилактика сальмонеллеза голубей /И.В. Чиркова //Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии: Сб. тр. мол. уч. – М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2006. – Вып.3. – С. 117-122.





Скачать 345,89 Kb.
оставить комментарий
Дата02.10.2011
Размер345,89 Kb.
ТипАвтореферат диссертации, Образовательные материалы
Добавить документ в свой блог или на сайт

плохо
  3
отлично
  1
Ваша оценка:
Разместите кнопку на своём сайте или блоге:
rudocs.exdat.com

Загрузка...
База данных защищена авторским правом ©exdat 2000-2017
При копировании материала укажите ссылку
обратиться к администрации
Анализ
Справочники
Сценарии
Рефераты
Курсовые работы
Авторефераты
Программы
Методички
Документы
Понятия

опубликовать
Загрузка...
Документы

наверх