Методические указания к лабораторным работам по дисциплине «Биотехнология растений» для студентов специальности 050701 «Биотехнология» очной формы обучения icon

Методические указания к лабораторным работам по дисциплине «Биотехнология растений» для студентов специальности 050701 «Биотехнология» очной формы обучения


Смотрите также:
Конспект лекций по дисциплине «Биотехнология растений» для студентов специальности 050701...
Научно-образовательный комплекс по кредитной технологии обучения опорные конспекты лекций по...
Научно-образовательный комплекс По специальности 050701 «Биотехнология» учебно-методический...
Научно-образовательный комплекс По специальности 050701 «Биотехнология» учебно-методический...
Научно-образовательный комплекс По специальности 050701 «Биотехнология» учебно-методический...
Научно-образовательный комплекс по специальности 050701 «Биотехнология» Методические указания...
Научно-образовательный комплекс по специальности 050701 «Биотехнология» учебно-методический...
Методические указания к выполнению курсовой работы по защите растений для студентов...
Научно-образовательный комплекс по специальности 050701 «Биотехнология» учебно-методический...
Методические указания к лабораторным занятиям и самостоятельной работе по дисциплине «Химические...
Методические указания к лабораторным работам По дисциплине...
Методические указания к лабораторным работам По дисциплине...



Загрузка...
страницы:   1   2   3   4   5
скачать



МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ

РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН


ИННОВАЦИОННЫЙ ЕВРАЗИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ


Методические указания

К ЛАБОРАТОРНЫМ работам


по дисциплине «Биотехнология растений»


для студентов специальности

050701 «Биотехнология»

очной формы обучения


ПАВЛОДАР 2008 год

УТВЕРЖДЕНО

Директор Инженерной Академии

Док. вет. наук, проф. _________ Е.Б. Никитин

«___» _______________ 2008 г.


Автор: преподаватель И.В. Тимофеева


Кафедра «Прикладная биотехнология»


^
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЛАБОРАТОРНЫМ РАБОТАМ



по дисциплине «Биотехнология растений»


для студентов специальности 050701 «Биотехнология»

очной формы обучения

на базе общего среднего образования


Разработана на основании Государственного общеобязательного стандарта высшего образования ГОСО РК 3.08.076-2004 и Типовой учебной программы по дисциплине «Биотехнология растений» специальности 050701 «Биотехнология» (г. Алматы, 2005г.)


Утверждена на заседании научно-методического совета Инженерной Академии и рекомендована к изданию

Протокол № ____ от __________2008г.


Председатель НМС факультета

очного обучения

Инженерной академии

Канд. техн. наук, профессор ______________ Е.К. Ордабаев


Рассмотрена на заседании кафедры «Прикладная биотехнология»

Протокол № 2 от 26 сентября 2008 г.


Зам. зав. кафедрой «Прикладная биотехнология»

Канд. техн. наук, профессор _______________ М.С. Омаров

Согласовано:

Начальник ИМО ______________ Н.М. Ушакова


Содержание

Введение................................................................................................................................................4

Лабораторная работа № 1....................................................................................................................9

Лабораторная работа № 2....................................................................................................................11

Лабораторная работа № 3....................................................................................................................13

Лабораторная работа № 4....................................................................................................................14

Лабораторная работа № 5....................................................................................................................16

Лаборатроная работа № 6....................................................................................................................17

Лабораторная работа № 7....................................................................................................................18

Лабораторная работа № 8....................................................................................................................20

Лабораторная работа № 9....................................................................................................................21

Лабораторная работа № 10..................................................................................................................22

Лабораторная работа № 11..................................................................................................................23

Лабораторная работа № 12..................................................................................................................25

Лабораторная работа № 13..................................................................................................................26

Лабораторная работа № 14..................................................................................................................28

Лабораторная работа № 15..................................................................................................................29

Список литературы..............................................................................................................................31


Введение

Общая тематика лабораторных работ

Лабораторная работа № 1 Методы стерилизации растительного материала, посуды, инструментов и питательных сред.

Лабораторная работа № 2 Приготовление питательных сред.

Лабораторная работа № 3 Выращивание стерильных проростков.

Лабораторная работа № 4 Выделение и культивирование апикальных меристем картофеля.

Лабораторная работа № 5 Микроразмножение картофеля черенкованием побегов.

Лабораторная работа № 6 Выделение и культивирование апикальных меристем земляники. Микроклональное размножение земляники.

Лабораторная работа № 7 Индукция корнеобразования при микроклональном размножении на примере земляники.

Лабораторная работа № 8 Каллусная культура.

Лабораторная работа № 9 Соматический эмбриогенез в каллусной ткани.

Лабораторная работа № 10 Суспензионная культура. Получение суспензионной культуры из каллуса.

Лабораторная работа № 11 Подсчёт плотности клеток в суспензионной культуре.

Лабораторная работа № 12 Высев суспензии на твёрдую агаризованную среду (метод Плейтинга).

Лабораторная работа № 13 Выделение протопластов: приготовление ферментных растворов и ферментация тканей.

Лабораторная работа № 14 Культивирование протопластов, выделенных из мезофила листа

Лабораторная работа № 15 Индивидуальное культивирование протоластов в микрокаплях.


^ Основные цели и задачи выполнения лабораторных работ

Цели:

Знать способы стерилизации помещений, растительного материала, посуды, инструментов и питательных сред; состав питательных сред; методики выделения апикальных меристем растений, протопластов из мезофилла листа, получения суспензионных культур и их выращивание на питательных средах.

Уметь пользоваться методиками приготовления питательных сред; выделять апикальные меристемы растений; выращивать стерильные проростки семян гороха, сои; выделять протопласты из мезофилла листа.


Задачи:

Ознакомиться со способами стерилизации объектов биотехнологии растений, с методиками приготовления питательных сред.

Научиться культивировать стерильные проростки, апикальные меристемы растений картофеля, земляники, табака.

Научиться получать суспензии, выращивать из на твёрдых и жидких питательных средах, вести подсчёт плотности клеток.

Научиться выделять протопласты из мезофилла листа, культивировать их на стерильных питательных средах.


^ Теоретическое обоснование лабораторных работ

Одно из основных условий успешного культивирования изолированных органов, тканей, клеток и протопластов состоит в соблюдении строгой стерильности. Тщательная стерилизация необходима, так как на искусственных питательных средах, предназначенных для культивирования растительных тканей и клеток хорошо развиваются и микроорганизмы, что создает опасность для культивируемого материала. Стерилизуют бокс, инструменты, посуду, растительный материал, питательные среды, ватные пробки и все другие материалы, необходимые для работы.

Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям макроэлементы, витамины, углеводы, фитогормоны. В качестве источников ауксинов в питательных средах обычно используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д)- 1-10 мг/л, а также индолилуксусную кислоту (ИУК) – 1-30 мг/л, и -нафтилуксусную кислоту (НУК) – 0,1-2 мг/л. ИУК почти в 30 раз менее активна, чем 2,4-Д.

Стерильные проростки выращивают с целью получения асептических растений и получения эксплантов in vitro. В зависимости от задачи опыта семена высевают на воду или агаризованную питательную среду.

Существуют три возможных пути использования стерильных проростков: 1) для получения эксплантов из дифференцированных тканей, которые при переносе на питательную среду, содержащую фитогормоны, дифференцируются и в результате интенсивной пролиферации образуют каллусную ткань; 2) для получения каллуса непосредственно на проростках; 3) для получения протопластов из частей проростка, обычно из листьев, иногда из корней.

Из апикальных меристем в питательной среде получают безвирусные растения картофеля, которые могут быть размножены и высажены в теплицы для получения безвирусных клубней. Для ускоренного размножения материала используются также клубни, полученные in vitro.

Размножение черенкованием основано на подавлении апикального доминирования и активации пазушных меристем при удалении верхушки побега. Из пазушной почки развивается побег.

При культивировании апикальных меристем земляники на питательной среде с высоким содержанием кинетина (0,5-1 мг/л) под действием этого гормона происходит подавление апикального доминирования верхушечной меристемы и активация пазушных меристем.

Каллусы на искусственных питательных средах, включающих фитогормоны, легко образуются на эксплантах из самых различных органов: из асептически прорастающих семян, отрезков стеблей и корней, изолированных фрагментов паренхимы, тканей клубня, изолированной сердцевины стебля, из листа, зародышей и др. Сущность метода выращивания изолированных тканей растений и получения каллуса заключается в том, что выделенный кусочек ткани (эксплант) стерилизуют и переносят на искусственную питательную среду, содержащие минеральные соли, органические вещества, фитогормоны. На такой питательной среде клетки начинают делиться.

Регенерацию in vitro рассмотрим на примере соматического эмбриогенеза у люцерны. Переход дедифференцированных каллусных клеток к вторичной дифференцировке и образование организованных структур в каллусной ткани зависят от соотношения гормонов в питательной среде. Преобладание цитокининов над ауксинами приводит к индукции стеблевого органогенеза или к соматическому эмбриогенезу. Преобладание ауксинов над цитокининами способствует образованию корней в каллусной ткани-корневому органогенезу.

Суспензия представляет собой одиночные клетки и агрегаты, которые растут в жидкой питательной среде определенного состава в стерильных условиях. Существуют разные способы культивирования суспензии: в колбах на качалках, ферментерах. Необходимое условие роста суспензии состоит в перемешивании или встряхивании среды, что обеспечивает аэрацию культур. Обычно суспензию получают из рыхлой каллусной ткани, помещая ее в жидкую питательную среду того же состава, что и для каллуса, но без агара. Растительные суспензии характеризуют по следующим показателям: количество жизнеспособных клеток, сегрегированность суспензии и плотность клеток в суспензионной культуре.

Одним из основных показателей, характеризующих суспензию, служит плотность клеточной популяции. Число клеток определяют после мацерации (разделения клеток) суспензии. Подсчет клеток ведется в счетной камере под микроскопом.

Для проведения клеточной селекции обычно применяют высев мелкоагрегированной суспензии в агаризованную среду. При этом одиночные клетки и мелкие агрегаты дают начало клеточным клонам. Конечная цель клеточной селекции-получение растений из клеточных клонов.

Клеточные оболочки у растений представлены главным образом целлюлозой, гемицеллюлозой и пектиновыми веществами. Поэтому для разрушения оболочки используют ферментные смеси на основе целлюлаз, гемицеллюлаз и пектиназ. Ферментные растворы лучше готовить непосредственно перед опытом. Для ферментации используют молодые листья, предварительно осажденную суспензионную культуру или каллусные ткани, растущие на агаре. Длительность ферментации зависит от типа ткани, состава ферментных растворов, температуры инкубации.

Растительные протопласты, высеянные на питательную среду, через три-четыре дня регенерируют клеточную оболочку и переходят к делению. К 12-14-му дню практически все клетки, начавшие делиться, превращаются в микроколонии. Сосотоящие из 20-40 клеток микроколонии переносят на среду для подращивания, где они превращаются в хорошо пролиферирующие каллусные ткани. Из каллусов можно получить растения-регенеранты.

Культивирование небольших количеств клеток в микрообъеме питательной среды оказывается полезным при изучении их жизнедеятельности.

Протопласты и единичные клетки растений хорошо растут при определенной плотности высева. Если плотность менее 103 клеток на 1 мл среды, то происходит заметная диффузия в среду промежуточных продуктов их метаболизма, что часто приводит к гибели клеток. Обычно протопласты растений культивируют при плотности 104-105 на 1 мл, а индивидуальное культивирование протопластов проводят в микрокаплях объемом 10-100 нл.


^ Оборудование и техническое оснащение лабораторных работ

Семена, клубни, побеги и стебли растений, культура каллусной ткани

Стаканы химические, колбы с дистиллированной водой, чашки Петри, предметные стекла, скальпель, пинцет, иглы, пинцеты, стерильные скальпели, марлевые мешочки, стерилизаторы, пробирки, чашки с питательными средами, фильтры Зейца или «Миллипор» для холодной стерилизации, вата, 96%-ный спирт, 0,1%-ный раствор сулемы или диацид, стерильная вода.

Автоклав, сушильный шкаф.


^ Требования к порядку выполнения лабораторных работ

Лабораторная работа проводится строго в лаборатории, в белых халатах, с соблюдением техники безопасности.

Лабораторная работа выполняется строго по порядку, определённому методикой ведения работы.


^ Требования к отчету по лабораторным работам

Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, поэтапно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы.

Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, таблиц или в графическом виде (при необходимости зарисовывать результат).


Контрольные вопросы

  1. Что такое стерильность?

  2. Какими способами стерилизуют посуду, инструменты?

  3. Какими способами стерилизуют растительные объекты?

  4. Каков состав питательных сред?

  5. Какие вещества используют в качестве ауксинов в питательных средах?

  6. Что такое маточные растворы и как их готовят?

  7. Какова цель выращивания стерильных проростков?

  8. Каковы возможные пути использования стерильных проростков?

  9. Какие среды используют для выращивания стерильных проростков?

  10. Какие части растения используют для ускоренного размножения?

  11. С какой целью из растений вычленяют апикальные меристемы?

  12. Какими способами пользуются в работе во избежание подсыхания питательных сред?

  13. Назовите наиболее распространённый способ размножения картофеля.

  14. На чём основывается действие размножения черенкованием?

  15. При каком условии в культуре in vitro у черенков картофеля можно индуцировать появление клубней?

  16. Каким образом высокое содержание кинетина в среде влияет на процесс культивирования земляники?

  17. Каким способом можно индуцировать корнеобразование при микроразмножении земляники?

  18. В каких растворах и с какой целью промывают марлевые мешочки с почками?

  19. Каким способом можно индуцировать корнеобразование при микроразмножении земляники?

  20. Что происходит при культивировании апикальных меристем земляники на питательной среде, содержащей цитокинин?

  21. При каких условиях проводят корнеобразование проростков при микроклональном размножении земляники?

  22. В чём заключается сущность метода выращивания изолированных тканей растений и получения каллуса?

  23. Что представляет собой каллус?

  24. Из каких органов на искусственных питательных средах могут образоваться каллусы?

  25. От чего зависят переход дедифференцированных каллусных клеток к вторичной дифференцировке и образование организованных структур в каллусной ткани?

  26. Что происходит с каллусной тканью люцерны при пересадке ее на среду, содержащую 0,2 мг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП)?

  27. Что нужно предпринять, если наблюдается нарушение нормального развития растений?

  28. Что представляет собой суспензионная культура?

  29. Какие вещества можно синтезировать в культуре клеток?

  30. Каковы условия роста суспензии?

  31. Что служит одним из основных показателей, характеризующих суспензию?

  32. Каковы фазы ростового цикла суспензии?

  33. Каким образом ведут подсчёт плотности суспензии?

  34. Какие суспензии применяют для проведения клеточной селекции?

  35. Какова конечная цель клеточной селекции?

  36. В чём заключается метод Плейтинга?

  37. Какие вещества используют для разрушения клеточной оболочки?

  38. От чего зависит длительность ферментации?

  39. Объясните технику выделения протопластов из мезофилла листа табака.

  40. Когда растительные протопласты можно считать микроколонией?

  41. Какова оптимальная плотность высева протопластов?

  42. Какие питательные среды используют для культивирования протопластов?

  43. В чём заключается индивидуальное культивирование клеток?

  44. Какова выживаемость протопластов при культивировании в микрокаплях?

  45. Как происходит рассаживание протопласьов по каплям?



Лабораторная работа №1

^ МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ РАСТИТЕЛЬНОГО

МАТЕРИАЛА, ПОСУДЫ,

ИНСТРУМЕНТОВ И ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Цель работы. Стерилизация помещений, растительного материала, посуды, инструментов и питательных сред.

^ Теоретическое обоснование. Одно из основных условий успешного культивирования изолированных органов, тканей, клеток и протопластов состоит в соблюдении строгой стерильности. Тщательная стерилизация необходима, так как на искусственных питательных средах, предназначенных для культивирования растительных тканей и клеток хорошо развиваются и микроорганизмы, что создает опасность для культивируемого материала. В результате жизнедеятельности организмов изменяется состав питательных сред. Кроме того, изолированные от растения ткани, клетки и особенно протопласты легко повреждаются микроорганизмами. Поэтому все опыты с культурой изолированных органов, тканей, клеток и протопластов растений проводят в ламинар-боксах. Стерилизуют бокс, инструменты, посуду, растительный материал, питательные среды, ватные пробки и все другие материалы, необходимые для работы.

^ Оборудование и техническое оснащение лабораторной работы. Семена, клубни, побеги и стебли растений.

Стаканы химические на 500-700 мл, колба с дистиллированной водой на 1 л, чашки Петри, предметные стекла, скальпель, пинцет, игла, марлевые мешочки, стерилизаторы, пробирки, чашки с питательными средами, фильтры Зейца или «Миллипор» для холодной стерилизации.

Автоклав, сушильный шкаф.

^ Содержание и порядок выполнения лабораторной работы

Ламинар-бокс. Протирают внутреннюю рабочую поверхность ламинара 70%-ным спиртом. Затем размещают в ламинаре спиртовую горелку, спички, стакан с96%-ным спиртом, стерильную посуду и инструменты, колбу со стерильной водой. При проведении работ по вычленению меристем в ламинар ставят бинокулярную лупу. Ламинар-бокс облучают бакткрицидными ультрафиолетовыми лампами в течение 10-12 ч.

Посуда. Стерилизация проводится в сушильном шкафу или в автоклаве. Перед стерилизацией посуду надо вымыть и высушить. Для мытья посуды используют детергенты, а также раствор двухромовокислого калия в серной кислоте (хромпик). Перед стерилизацией пробирки, колбы предварительно закрывают ватными пробками, заворачивают в оберточную бумагу. Затем посуду помещают в сушильный шкаф и нагревают при температуре +175оС в течение 2 ч (после того как установится нужная температура). При таком нагревании погибают не только бактерии, но и их споры. Температуру в сушильном шкафу выше 175оС допускать не следует, так как при этом ватные пробирки буреют, а бумага, которой закрывают ватную пробку сверху, становится ломкой.

Еще более строгой стерилизации можно добиться под давлением в автоклаве, так как влажный жар эффективнее убивает микроорганизмы и их споры, чем сухой. Автоклавированию подвергают стаканы с крышками, чашки Петри, пипетки, колбы с дистиллированной водой. Посуду заворачивают в фольгу или оберточную бумагу и автоклавируют при 2 атм. В течение 25-30 минут. Верхнюю часть градуированных пипеток закрывают ватной прокладкой, пипетки заворачивают в бкмагу по 10 штук.

Инструменты. Предварительную стерилизацию инструментов скальпелей, пинцетов, игл и т.д. проводят нагреванием сухим горячим жаром в сушильном шкафу в течение 12 ч при 140оС. Кипячением удобно стерилизовать шприцы. Металлические предметы нельзя стерилизовать автоклавированием, так как под действием пара они ржавеют и тупятся. Непосредственно перед работой и в процессе посадки инструменты стерилизуют дополнительно, помещая в фарфоровый стакан с 96%-ным этиловым спиртом и обжигая в пламени спиртовки. Обжигать можно ланцеты, пинцеты, микробиологические петли. После стерилизации обжиганием каждый инструмент помещают между листами предварительно простерилизованной плотной бумаги, сложенными в пачку или в специальный штатив. Стерильный инструмент используют только для одноразовой манипуляции. Затем его следует снова простерилизовать спиртом и обжечь. Очень тонкие инструменты (иглы, кусочки лезвий) могут терять свои свойства при обжигании, поэтому их стерилизуют, погружая в спирт.

Материалы. Вату, марлю, ватные пробки, фильтровальную бумагу, халаты, косынки, которые могут использоваться при посадке тканей, стерилизуют в автоклаве под давлением 2 атм. В течение 25-30 мин.

^ Растительный материал. Для стерилизации семян, верхушечных меристем, кусочков ткани, выделенных из различных частей растения, применяют различные стерилизующие растворы: водные растворы сулемы, или двуххлористой ртути (0,1%), брома (1%), пергидроля (20-30%), хлорамина (3-6%), диацида, гипохлорита натрия (10%).

Диацид готовят следующим образом: растворяют отдельно 330 мг этанолмеркурхлорида и 660 мг цетилпиридинилхлорида в горячей воде (около 300 мл), смешивают полученные растворы, доводят объем жидкости дистиллированной водой до 1 л и добавляют несколько капель детергента Твин-80. Диацид хранят в холодильнике в плотно закрытой колбе в темноте.

Прежде чем приступить к стерилизации растительной ткани, ее предварительно очищают. Корнеплоды, клубни, толстые стебли растений тщательно моют щеткой с мылом в теплой проточной воде, снимают кожуру (у корней и клубнеплодов), кору (у побегов), промывают дистиллированной водой и опускают на несколько секунд в абсолютный спирт. При этом кроме действия спирта отмечается усиление эффекта основного стерилизующего раствора. После стерилизации растительные объекты следует тщательно отмыть от стерилизующих веществ, многократно последовательно ополаскивая дистиллированной водой.

Диацид рекомендуется использовать при стерилизации семян кукурузы, пшеницы, ржи; пергидроль для фасоли, люпина, подсолнечника (с очищенной кожурой), томатов, редиса и др. Время стерилизации семян диацидом 15-20 мин, пергидролем 10 мин. Некоторые семена (хлопчатник, горох) хорошо стерилизуются концентрированной серной кислотой в течении 3 мин, с последующей пятикратной промывкой автоклавированной дистиллированной водой. Время стерилизации меристем и кусочков тканей из разных частей растения примерно вдвое меньше. Обычно используют диацид, который затем отмывают водой, воду меняют 5-6 раз.

Иногда семена некоторых растений: помидор, яблони, тыквы, бобов и табака, не обрабатывают антисептиком. Ко времени созревания семена оказываются заключенными в мясистые, деревянистые или костянковидные покровы. Здоровые с неповрежденной поверхностью плоды этих культур тщательно промывают мыльной водой, затем несколько раз спиртом. После этого в строго асептических условиях их разламывают. Стерильным инструментом из разлома выбирают семена и помещают их в стерильную посуду.

^ Питательные среды. Колбы и пробирки с питательными средами закрывают ватными пробками, завертывают горлышко в целлофан или оберточную бумагу и автоклавируют при температуре 120оС и давлении 1 атм. В течение 20 мин.

^ Холодная стерилизация. Органические жидкости, которые не выносят нагревания, освобождают от бактерий при пропускании через стерильные мелкопористые бактериальные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм.

^ Требования к отчету по лабораторной работе.

Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, поэтапно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы.

Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.

Контрольные вопросы

1. Что такое стерильность?

2. Какими способами стерилизуют посуду, инструменты?

3. Какими способами стерилизуют растительные объекты?

Литература

1. Биотехнология растений: культура клеток. М., ВО Агропромиздат, 1989.

2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, Наукова думка, 1980.

3. Валиханова Г.Ж.и др. Методическое руководство к практическим занятиям по культуре клеток растений. Алматы, КазГУ, 1983.

  1. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, Іонжиє, 1996.

  2. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999.

  3. Шевелуха В.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998.


Лабораторная работа № 2

^ ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Цель работы. Приготовление питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей на примере среды Мурасиге-Скуга

^ Теоретическое обоснование. Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям макроэлементы, витамины, углеводы, фитогормоны. Некоторые питательные среды содержат гидролизат казеина, определенные аминокислоты. Кроме того, в состав питательных сред входит ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или ее натриевая соль, повышающие доступность железа для клеток в широких пределах рН.

Углеводы выступают необходимым компонентом питательных сред при культивировании изолированных клеток и тканей, так как они не способны к автотрофному питанию. Обычно в качестве источника углеводов используют сахарозу или глюкозу в концентрациях 20-40 г/л. Опухолевые ткани, в которых много активных гидролитических ферментов, могут расти на средах с растворенным крахмалом.

Регуляторы роста необходимы для дифференцировки клеток и для индукции клеточных делений. Поэтому для получения каллусных тканей в состав питательных сред должны входить ауксины, вызывающие клеточную дедифференцировку, и цитокинины, индуцирующие деление дедифференцированных клеток. В случае индукции стеблевого морфогенеза можно снизить содержание ауксинов в среде или исключить их из питательной среды. На средах без гормонов растут опухолевые и «привыкшие» к таким условиям ткани. Автономность по отношению к гормонам того и другого типа или к одному из них связана со способностью клеток синтезировать гормоны.

В качестве источников ауксинов в питательных средах обычно используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д)- 1-10 мг/л, а также индолилуксусную кислоту (ИУК) – 1-30 мг/л, и -нафтилуксусную кислоту (НУК) – 0,1-2 мг/л. ИУК почти в 30 раз менее активна, чем 2,4-Д. Для индукции образования каллуса обычно применяют высокие концентрации ауксинов, а при последующих пересадках ткань может расти, если содержание ауксинов в среде уменьшено в несколько раз.

В качестве источника цитокининов в искусственных питательных смесях используют кинетин, 6-бензиламинопурин (6-БАП), зеатин (0,001-10 мг/л). Зеатин и БАП более активны в поддержании роста изолированных тканей и индукции органогенеза, чем кинетин. В состав некоторых питательных смесей входит аденин.

Отдельные питательные среды включают кроме ауксинов и цитокининов гибберелловую кислоту (ГК). Иногда к питательной среде добавляют растительные экстракты или соки. Наибольшей ростактивирующей способностью обладает кокосовое молоко-жидкий эндосперм кокосового ореха.

Для приготовления твердых питательных сред используют агар-агар-полисахарид, получаемый из морских водорослей. Наименьшее количество нежелательных примесей содержат бактериальный агар «Difco» и бактериальный агар отечественного производства, их можно применять без предварительной промывки. Обычно для получения твердой питательной смеси к среде добавляют 5-8% агара.

Растворы макросолей, микросолей и витаминов удобно готовить концентрированными. Маточные растворы хранят в холодильнике, витамины при отрицательной температуре. В 10-20 раз более концентрированными, чем нужно, готовят растворы макросолей, в 100-1000 раз более концентрированными-растворы микросолей, в 1000 раз-растворы витаминов.

Для культивирования клеток, тканей и органов тех или иных растенийиспользуют питательные среды различного состава. Наиболее широко применяются среда Мурасиге-Скуга (табл.1, 2), среда Уайта (табл.2.3), среда Гамборга, или В-5 (табл.2.4).

^ Оборудование и техническое оснащение лабораторной работы. Химреактивы (табл.1). Колбы или стаканы химические на 1л, банки с притертыми пробками для хранения маточных растворов на 1л и 100мл, баночки на 20-50мл, мерные пипетки на 10 и 1мл, весы технические, весы торзионные, электроплитка.

^ Содержание и порядок выполнения лабораторной работы. Приготовить питательную среду Мурасиге и Скуга (табл.1, 2) для культивирования растительных органов и тканей.


Прежде всего необходимо приготовить маточные растворы макро-, микросолей и витаминов. Для среды Мурасиге и Скуга обычно готовят маточные растворы следующего состава: 1) NH4NO3, KNO3, KH2PO4, MgSO4 .7H2O (MgSO4 . 7H2O вливают последним без нагревания, что предотвращает выпадение осадка); 2) раствор CaCl2 ; 3) раствор хелата железа (раствор FeSO4 и ЭДТА-Na2, необходимый для образования хелата железа, следует нагреть до кипения); 4) раствор микроэлементов.

Количество солей, необходимое для приготовления маточных растворов, а также количество маточного раствора, которое надо взять для приготовления питательной среды, приведены в табл. 2.2.

Полученные растворы сливают в склянки с притертой пробкой, снабжают этикеткой и хранят в холодильнике. Хелат железа хранят в темной склянке.

Концентрированные растворы витаминов (каждого в отдельности) хранят во флакончиках. Для приготовления растворов берут десятикратную по отношению к добавляемой дозе навеску витамина и растворяют в 10 мл воды. В 1 мл этого раствора содержится порция витамина, необходимая для приготовления 1 л раствора по прописи Мурасиге-Скуга.

Теперь, используя маточные растворы, надо приготовить питательные среды для культивирования органов и тканей растений. В химический стакан или колбу емкостью 1л помещают навеску сахарозы 30 г, доливают до половины дистиллированную воду, нагревают, после растворения сахарозы добавляют необходимые количества маточных растворов макросолей, микросолей (см. табл. 2.2.), витаминов и доводят объем до 1л дистиллированной водой.

Растворы фитогормонов готовят следующим образом.

Ауксины ( 2,4-Д, -НУК, ИУК, индолил-масляная кислота – ИМК): 100 мг вещества растворяют в 0,5-2 мл спирта, подогревают, добавляют дистиллированную воду до 100 мл (концентрация 1 мг/мл).

Цитокинины (кинетин, зеатин, БАП): растворяют в небольшом объеме 0,5 н. HCl, подогревают, добавляют соответствующий объем дистиллированной воды.

^ Абсцизовая кислота (АБК): навеску растворяют в 70%-ном этаноле, доводя до нужного объема.

Гиббереллиновая кислота (ГК): навеску растворяют в воде.

При введении фитогормонов в среду перед автоклавированием следует обязательно довести рН среды до 5,5-5,6. Однако следует учитывать, что после автоклавирования изменяется первоначальный состав термолабильных компонентов среды. Так, тиамин распадается на пиримидин и тиазол, а кинетин и ИУК теряют часть своей активности. В связи с этим витамины и особенно термолабильные фитогормоны стерилизуют фильтрованием, пропуская через фильтр Зейца или «Миллипор» с диаметром пор 0,4 мкм (НУК, ИУК, зеатин, БАП). В этом случае для регуляции рН среды используют стерильные растворы щелочи.

Агар-агар предварительно замачивают в воде для набухания. Затем его нагревают на электроплитке при помешивании до полного растворения. После этого раствор агара надо слить с раствором солей, витаминов и сахарозы и довести объем среды до 1л. Колбы со средой закрывают ватной пробкой, бумагой или фольгой и стерилизуют в автоклаве.

Питательные среды разливают в пробирки (1/3 объема), которые закрывают ватными пробками или фольгой, стерилизуют в автоклаве.

^ Требования к отчету по лабораторной работы

Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, поэтапно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы.

Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.

Контрольные вопросы.

1. Каков состав питательных сред для изолированных клеток и тканей?

2. Какие вещества используют в качестве ауксинов в питательных средах?

3. Что такое маточные растворы и как их готовят?

Литература

1. Биотехнология растений: культура клеток. М., ВО Агропромиздат, 1989.

2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, Наукова думка, 1980.

3. Валиханова Г.Ж.и др. Методическое руководство к практическим занятиям по культуре клеток растений. Алматы, КазГУ, 1983.

  1. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, Іонжиє, 1996.

  2. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999.

  3. Шевелуха В.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998.

Приложение.

^ Таблица 1. Среда Мурасиге и Скуга, рН 5,6-5,8


Компоненты

Содержание,

мг/л

Компоненты

Содержание,

мг/л

NH4NO3

1650

Fe2SO4 7H2O

27,8

KNO3

1900

Na2-ЭДТА 2H2O

37,3

CaCl2 . 2H2O

440

Тиамин - HCl

0,1

MgSO4 . 4H2O

370

Пиридоксин - HCl

0,5

KH2PO4

170

Никотиновая кислота

0,5

MnSO4 . 4H2O

22,3

Мезо-инозит

100

CoCl2 . 6H2O

0,025

Глицерин

2,0

ZnSO4 . 7H2O

8,6

ИУК

2,0

CuSO4 . 5H2O

0,025

Кинетин

0,2

Na2MoO4 . 2H2O

0,25

Сахароза

30.000

Kl

0,83








^ Таблица 2. Состав маточных растворов по Мурасиге и Скугу


Компоненты питательной среды

Примечание

Макросоли, г/л маточного раствора

КNO3 38

CaCl2 (безводный) 8,8

NH4NO3 33

или CaCl2 . 2H2O 13,8

MgSO4 (безводный) 3,6

или MgSO4 .7H2O 7,4

KH2PO4 3,4

На 1 л среды брать по 50мл маточного раствора

Микросоли, мг/100 мл маточного раствора

H3PO4 620

MnSO4 . 4H2O 2230

ZnSO4 860

Kl 83

Na2MoCl4 . 2H2O 25

CuSO4 . 5H2O 2,5

CoCl2 . 6H2O 2,5

На 1 л среды брать по 1 мл маточного раствора

Fe-хелат, мг/100 мл маточного раствора

FeSO4 .7H2O 557

ЭДТА-Na2 (трилон Б) 745

На 1 л среды брать по 5 мл маточного раствора






Скачать 1,19 Mb.
оставить комментарий
страница1/5
И.В. Тимофеева
Дата30.09.2011
Размер1,19 Mb.
ТипМетодические указания, Образовательные материалы
Добавить документ в свой блог или на сайт

страницы:   1   2   3   4   5
хорошо
  1
отлично
  2
Ваша оценка:
Разместите кнопку на своём сайте или блоге:
rudocs.exdat.com

Загрузка...
База данных защищена авторским правом ©exdat 2000-2017
При копировании материала укажите ссылку
обратиться к администрации
Анализ
Справочники
Сценарии
Рефераты
Курсовые работы
Авторефераты
Программы
Методички
Документы
Понятия

опубликовать
Загрузка...
Документы

наверх