СтандартизациЯ конского каштана обыкновенного ( aesculus hippocastanum L. ) семян и экстракта сухого на их основе 15. 00. 02 Фармацевтическая химия, фармакогнозия icon

СтандартизациЯ конского каштана обыкновенного ( aesculus hippocastanum L. ) семян и экстракта сухого на их основе 15. 00. 02 Фармацевтическая химия, фармакогнозия


Смотрите также:
Разработка способа получения и стандартизация экстракта жидкого противодиабетического 14. 04...
Молекулярное конструирование и целенаправленный синтез n производных 1,3-диазинона-4 14. 04...
Примерная программа рекомендуется для направления подготовки (специальности) 111801...
Разработка методик определения дицикловерина гидрохлорида и тропикамида в моче для целей...
Фармакогностическое изучение растений рода фиалка и спектр их фармакологической активности 14...
Разработка методик анализа для выявления фальсифицированных лекарственных средств 14. 04. 02...
Фитохимическое и технологическое исследование листьев осины обыкновенной 14. 04...
Пояснительная записка Фармацевтическая химия занимает ведущее место в системе высшего...
Урок биологии в 6-м классе по теме: "Условия прорастания семян"...
Исследования по стандартизации сырья и настоек гомеопатических матричных кактуса...
Рочитаны лекционные курсы и разработаны и проведены практические и лабораторные занятия по 7...
Методическое пособие по самоподготовке и выполнению контрольных работ для студентов IV курса...



Загрузка...
страницы:   1   2   3
скачать


На правах рукописи


Жарова Олеся Глебовна


стандартизациЯ конского каштана ОБЫКНОВЕННОГО

(AESCULUS HIPPOCASTANUM L.)

семян и экстракта сухого на ИХ основе


15.00.02 – Фармацевтическая химия, фармакогнозия


Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук


Москва 2009 г

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН


^ Научный руководитель:


Кандидат фармацевтических наук Шемерянкина Татьяна Борисовна


Официальные оппоненты:


Доктор фармацевтических наук,

профессор Даргаева Тамара Дарижаповна


Доктор фармацевтических наук Лякина Марина Николаевна


^ Ведущая организация:


ОАО Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ «ВНЦ БАВ» (г. Старая Купавна)


Защита состоится « 20 »  мая  2009 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 006.070.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЛАР по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7


Автореферат разослан « 17 »  апреля  2009 г.


Ученый секретарь диссертационного совета

Д 006.070.01,

доктор фармацевтических наук Громакова Алла Ивановна

^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В настоящее время среди населения наблюдается значительный рост сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), в том числе, хронической венозной недостаточности (ХВН). На сегодняшний день варикозная болезнь нижних конечностей является самой распространенной патологией периферических сосудов. Согласно эпидемиологическим данным различные формы этого заболевания встречаются у 26-38 % женщин и у 10-20 % мужчин трудоспособного возраста. Ежегодный прирост новых случаев заболевания у жителей индустриально развитых стран достигает 2,6 % среди женщин и 1,9 % среди мужчин. Специалисты связывают это с ухудшением экологии, увеличением частоты стрессовых ситуаций, употреблением спиртных напитков, курением, малоподвижным образом жизни, статическими перегрузками. По возрастным особенностям ССЗ имеют тенденцию к омоложению.

Варикозная болезнь является не только косметической проблемой: варикотромбофлебиты, трофические нарушения кожи, язвы значительно снижают трудоспособность, нарушают социальную адаптацию и качество жизни больных, а также может привести к инсульту, инфаркту миокарда и тромбоэмболии легочных артерий, которые чреваты летальным исходом. Именно поэтому лечение венозной недостаточности нужно начинать с самых ранних доклинических стадий развития заболевания. К сожалению, для большинства пациентов, да и врачей, необходимость лечения ХВН ассоциируется с осложненными формами заболевания уже на поздних его стадиях, когда реальную помощь больному может оказать только хирург. Вместе с тем, это заболевание на ранних стадиях является исключительно терапевтической проблемой, требующей только своевременного лечения.

До сих пор не создано универсальных препаратов для лечения ХВН. Спектр действия большинства из них достаточно узок (декстраны влияют на реологию крови, антиагреганты уменьшают агрегационную активность тромбоцитов, венотоники улучшают тонус венозной стенки). Для достижения оптимального лечебного эффекта врачам приходится применять несколько препаратов разных фармакотерапевтических групп. Таким образом, идеальный препарат для лечения ХВН должен воздействовать на как можно большее количество патогенетических звеньев заболевания, при этом иметь минимальное количество побочных эффектов и высокую биодоступность. Именно растительные препараты наиболее полно отвечают этим требованиям.

За рубежом номенклатура этих лекарственных средств чаще всего представлена препаратами на основе сырья конского каштана обыкновенного (Анавенол, Венитан, Эскузан, Эссавен-гель, Веноплант и другие), составляющих 70 % рынка ангиопротекторных и венотонизирующих средств. В России процент таких средств ничтожно мал. В связи с этим целесообразно вести разработки новых фитопрепаратов с венотонизирующими свойствами.

Венотонизирующее и ангиопротекторное действие большинства из известных фитопрепаратов обусловлено тритерпеновыми гликозидами (ТГ) семян конского каштана обыкновенного.

В последние годы фармацевтическими субстанциями служат экстракты, полученные из растительного сырья с использованием специальной технологии и стандартизованные по основным биологически активным соединениям (БАС). Учитывая вышеприведенные факты, представляется актуальной разработка эргономичных и валидированных методик контроля качества ЛРС конского каштана обыкновенного и получаемых на его основе субстанций.

^ Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является фармакогностическое и фитохимическое изучение семян конского каштана обыкновенного, разработка способа получения из них сухого экстракта и внедрение современных методик стандартизации качества этого сырья и субстанции.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить морфолого-анатомические признаки измельченных и цельных семян конского каштана обыкновенного и выявить наиболее диагностически значимые из них;

- разработать методики качественного и количественного анализа ТГ (эсцина) для оценки качества семян конского каштана;

- разработать и оформить проект нормативного документа на семена конского каштана - технические условия (ТУ);

- исследовать химический состав некоторых групп БАС в семенах конского каштана обыкновенного;

- разработать способ получения сухого экстракта из семян конского каштана, изучить его технологические свойства и оформить лабораторный регламент (ЛР) технологии его производства;

- разработать показатели и их нормы для контроля качества конского каштана семян экстракта сухого;

- разработать и оформить проект нормативного документа на конского каштана семян экстракт сухой - проект фармакопейной статьи (ФС).

^ Научная новизна работы

На основании макро- и микроскопического анализа выявлены диагностические признаки в анатомическом строении тканей измельченных семян конского каштана обыкновенного, предложены методики пробоподготовки для установления подлинности измельченных и цельных семян конского каштана методом микроскопии, что подтверждено оригинальными микрофотографиями.

Подобраны и отработаны условия проведения анализа ТГ (эсцина) в сырье и конского каштана семян экстракте сухом. Впервые разработаны унифицированные физико-химические методики как для контроля качества сырья, так и субстанции.

Впервые изучен качественный состав основных групп БАС (ТГ, флавоноидов и кумаринов, полисахаридов, моносахаридов, аминокислот, липидов и микроэлементов) в семенах конского каштана обыкновенного, произрастающего в Подмосковье.

Впервые изучено содержание ТГ, полисахаридов, моно- и дисахаридов, аминокислот, липидов и микро- и макроэлементов в сырье и сухом экстракте из него.

Подобраны параметры технологии получения сухого экстракта из семян конского каштана и разработан способ получения конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого, который оформлен в виде ЛР.

С учетом современных требований к стандартизации ЛРС и экстрактам сухим разработаны критерии для установления подлинности и контроля качества семян и сухого экстракта из них конского каштана обыкновенного.

^ Практическая значимость работы

На основании проведенных исследований разработаны и утверждены:

  • Технические условия ТУ 9377-075-04868244-2008 «Конского каштана обыкновенного семена».

  • Проект ФС «Конского каштана обыкновенного семян экстракт сухой».

  • Лабораторный регламент ЛР 04868244-02-08 на производство конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого.

Основные положения, выносимые на защиту:

        • Результаты фармакогностического исследования цельных и измельченных семян конского каштана обыкновенного.

        • Результаты разработки способа получения конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого.

        • Результаты фитохимического изучения состава БАВ семян и получаемого на их основе сухого экстракта.

        • Результаты разработки методик для стандартизации и контроля качества семян и получаемого на их основе сухого экстракта.

^ Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на 69-ой итоговой конференции СНО (Самара, 2001), 70-ой итоговой конференции СНО (Самара, 2002), XXVIII Самарской областной студенческой научной конференции (Самара, 2002), Міжнародної конференції студентів та молодих вчених «Медицина – здоров`я XXI сторіччя» (Днепропетровск, 2002), VI Международном съезде Фитофарм-2002 «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (С.-П., 2002), Мiжнародна науково-практична конференцii молодих вчених «Вченi майбутнього» (Одесса, 2002), 71-ой итоговой конференции СНО (Самара, 2003), X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003), Российской научно-практической конференции «Рациональное использование лекарств» (Пермь, 2004), VIII Международном съезде Фитофарм-2004 «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Финляндия, Миккели, 2004), IX Международном конгрессе «Здоровье и Образование в XXI веке» (Москва, 2008).

^ Связь задач исследований с проблемным планом НИР

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ВИЛАР по «Программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ на 2006-2010 гг.», задание 04, шифр 04.13 «Разработка технологий производства высокоэффективных лечебных и профилактических препаратов из растительного сырья».

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ в научных журналах, сборниках международных конференций и научных трудах.

^ Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 150 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), четырех глав экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 233 источника, в том числе 95 иностранных, 9 приложений. Работа содержит 22 рисунка и 31 таблицу.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе на основании обзора данных литературы дана общая характеристика ТГ растений, их физико-химические свойства, идентификация, методы количественного определения, способы выделения из лекарственного растительного сырья (ЛРС) и распространенность в природе. Отражена стандартизация качества сырья и препаратов из конского каштана обыкновенного. Изложены современные подходы к технологии получения сухих экстрактов из ЛРС. Приведены общие сведения о растении и БАС, накапливающихся в его органах. Рассмотрены фармакологическая активность и применение препаратов на основе семян конского каштана обыкновенного в медицине. Дана краткая характеристика номенклатуры лекарственных средств растительного происхождения и биологически активных добавок к пище (БАД), рекомендуемых для лечения ХВН. Обоснована целесообразность использования сырья и БАС конского каштана обыкновенного в качестве основы для создания средств с венотонизирующей активностью.

В разделе «Объекты и методы исследования» приведены сведения об объектах изучения, о методах и приборах, использованных нами в экспериментах.

Вторая глава посвящена совершенствованию фармакогностических и физико-химических методов контроля качества семян конского каштана обыкновенного.

В главе 3 представлены данные исследования состава БАС семян конского каштана обыкновенного с использованием современных физико-химических методов.

В четвертой главе изложены результаты исследований по подбору оптимальных условий и разработке способа получения конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого.

Пятая глава содержит сведения по изучению химического состава и установлению показателей качества конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого.

В приложении представлены материалы НД, формулы БАВ конского каштана обыкновенного; заключение о фармакологической активности полученной субстанции; номенклатура венотонизирующих и ангиопротектор-ных препаратов традиционной медицины и БАД; номенклатура венотони-зирующих препаратов, содержащих эсцин, зарегистрированные на территории РФ, их состав, показатели подлинности и доброкачественности.


Основное содержание работы

^ Объекты и методы исследования

Объектами для исследования служили образцы опытных партий зрелых семян конского каштана обыкновенного – Aesculus hippocastanum L., собранные с земли по мере созревания и осыпания плодов осенью в 2001-2003 годах на территории Самарской области, в 2004-2008 годах Ботаническом саду ВИЛАР Московской области. В опытах использовалось измельченное сырье. Измельчение сырья осуществляли на мельнице – экспериментальный измельчитель растительного материала МИР-1 (номинальная частота вращения 3000 об/мин, производительность 40 кг/ч). Измельченные семена просеивали через сито с отверстиями размером 0,5 и 3 мм по ТУ 23.2.2068-89. Товароведческий анализ проводили в соответствии с требованиями ГФ XI.

Отбор проб ЛРС и их анализ проводили по методикам ГФ XI и разработанными нами методами качественного и количественного определения ТГ. Микроскопический анализ цельного и измельченного сырья проводили согласно общей фармакопейной статье «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» ГФ ХI, изд. (вып. 1, С. 277-285). Поперечные срезы семян конского каштана сделаны на салазочном микротоме, микрофотографии – камерой Axiocam HRc на микроскопе AxioImager M1 (объективы 2,5х - EC Plann-Neofluar).

Для экстракции БАВ и приготовления хроматографических систем использовали растворители марки «ч» и «хч». Приготовление реактивов, используемых в экспериментальной части работы, осуществляли согласно ГФ XI вып.1 и 2. Концентрирование извлечений и отгонку растворителей осуществляли в вакуум-выпарном ротационном испарителе марки ИР-1М.

^ Тонкослойную хроматографию (ТСХ) выполняли на пластинках «Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ» (Россия) размером 15×15 и «Силуфол УФ 254» (Чехия) размером 10×10 см, при температуре (19-23) oС в герметически закрытых вертикальных стеклянных камерах. Нанесение исследуемых растворов на хроматографические пластинки осуществляли при помощи шприца Hamilton (10 мкл). Для ТСХ использовали систему растворителей: изопропанол-этилацетат-вода (40:40:30) и хлороформ-метанол-вода (26:14:3). Соотношение растворителей учитывали в объемных частях. Обнаружение зон адсорбции тритерпенгликозидов, флавоноидов и кумаринов проводили УФ-облучением (254 и 366 нм) после высушивания хроматограмм, до и после обработки хроматограмм 25 % спиртовым раствором кислоты фосфорновольфрамовой с последующим нагреванием при 110 0С и диазобензолсульфокислотой в насыщенном растворе натрия карбоната. Все значения Rf соединений рассчитаны как средние из пяти измерений.

^ Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) БАС семян и экстракта семян конского каштана обыкновенного. Для разработки методик качественного и количественного анализа методом ВЭЖХ был использован прибор «Agilent 1100 series» (США) с УФ-спектрофотометрическим детектором на диодной матрице (СДДМ) с последующей компьютерной системой для сбора и обработки хроматографических данных ChemStation for LC3D, Rev. A. 09.03 [1417], Agilent. В качестве неподвижной фазы использовалась хроматографическая колонка Waters 250х4,6 мм, заполненная сорбентом Symmetry C18 (США). В качестве подвижной фазы использована система растворителей: буферный раствор о-фосфорной кислоты (рН=2,5) - ацетонитрил в условиях градиентного элюирования. Для спектрофотометрического анализа исследуемых соединений использовался спектрофотометр фирмы GBC UV-visible Cintra 6 Spectrophotometer (Австралия) с диапазоном длин волн от 190 нм до 1100 нм. Детектирование проводили с помощью УФ-детектора при длине волны 210 нм.

При разработке методик и проведении аналитических исследований по содержанию индикаторных компонентов в качестве стандартных образцов нами были использованы коммерчески доступные хроматографически чистые индивидуальные вещества и стандарты: эскулин кат. № 0205885 Indofine, фраксин кат. № 03052603 Sigma; рутин – СО по ФС 42-2508-87, эсцин E1378-1 Sigma.

Определение содержания полисахаридов проводили гравиметрическим методом. Изучение состава моно- и дисахаридов семян и сухого экстракта из них конского каштана обыкновенного проводили с помощью ВЭЖХ. Жидкостной хроматограф «Agilent 1100 series» (США) с СДДМ с компьютерной системой ChemStation, Agilent. В качестве неподвижной фазы использовалась хроматографическая колонка 200х2,1 мм, заполненная сорбентом Kromasil 5μ NH2 (США); подвижной фазы – ацетонитрил-вода (77:23), скорость подвижной фазы 1,0 мл/мин., аликвота, вводимая в инжектор 10 мкл, использовался рефрактометрический детектор Merk L 7490 (Германия).

Изучение аминокислотного состава семян и сухого экстракта на их основе конского каштана обыкновенного проводили с помощью жидкостного хроматографа Agilent 1100 (США) с градиентным насосом высокого давления с подачей растворителя от 0,1 до 5,0 мл/мин, оборудованный СДДМ и флуориметрическим детектором, автосамплером, а также системой ChemStation, Agilent. В качестве неподвижной фазы использовалась хроматографическая колонка Agilent 200х2,1 мм, заполненная сорбентом Hypersil AA-ODS 5μ (США).

Определение группового состава липидов семян проводили методом ТСХ. Количественное определение отдельных групп липидов осуществляли денситометрическим методом на приборе «Хромоскан 200». Исследование липофильной фракции семян и сухого экстракта семян конского каштана проводили методом ГЖХ на приборе Carlo Erba Strumentazione, HRGC 5300, Mega Series (Италия) с пламенно-ионизационным детектором с использованием програмно-аппаратного комплекса для сбора и обработки хроматографических данных «МультиХром for Windows». Анализ метиловых эфиров высших жирных кислот осуществляли на колонке Chrompack Capillary 7420 100х0,25 мм, при температурном режиме – термостат колонок: 1100С (10 мин), 50/мин - 1750С (15 мин), 40/мин – 2000С (5 мин), 30/мин – 2250С (60 мин), температуре детектора 240 ºС и температуре инжектора 260 ºС. Газ носитель азот, скорость подачи элюента 1 мл/мин. Количественный анализ содержания отдельных жирных кислот определяли на интеграторе C-R6A Chromatopac фирмы Shimadzu. Расчет проводили методом внутренней нормализации.

Определение макро- и микроэлементного состава изучаемых объектов, включая микроэлементы проводили на спектрографе ДФС-8 с плоской дифракционной решеткой методом эмиссионного спектрального анализа.

Разработку способа получения сухого экстракта проводили в условиях лаборатории фитохимии ВИЛАР. Фармакологические исследования конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого проведены в отделе медицины ВИЛАР. Разработанные для количественного определения методики ВЭЖХ были подвергнуты валидации (оценке пригодности). С этой целью было проведено экспериментально-обоснованное доказательство их пригодности для получения результатов, имеющих достаточную точность, прецизионность (воспроизводи-мость), линейность и специфичность в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 и проектом ОФС «Валидация фармакопейных методов». Статистическая обработка результатов количественного определения проводилась в соответствии с требованиями ГФ XI изд. (вып.1, с. 199-207).

^ Совершенствование методов контроля качества

семян конского каштана обыкновенного

Пересмотрены Технические условия 1996 года «Семена конского каштана обыкновенного». В новые ТУ впервые изложены требования к измельченному сырью, уточнены некоторые характеристики цельного сырья, а также включены современные методики контроля качества этого сырья.

      Исследование морфологических и микроскопических признаков семян

На основании изучения морфологических характеристик образцов опытных партий, использованных для приготовления экстракта, составлено описание внешних признаков «Конского каштана обыкновенного семена».

В доступной литературе отсутствовала информация о массе семян. Использованные для приготовления экстракта семена конского каштана обыкновенного имели широкий диапазон значений масс. В среднем масса семян составляла 7,0±3,0 г. Отбор аналитических проб для семян таких размеров и массы среди официнального растительного сырья из морфологической группы Semina требуют особой методики. На основании этого в ТУ включены массы аналитических проб для определения микробиологической и радионуклидной чистоты. В ТУ впервые включено описание пробоподготовки семян конского каштана обыкновенного.

Для выявления диагностических признаков в анатомическом строении проведено микроскопическое исследование цельных семян, что подтверждено оригинальными микрофотографиями. В микропрепаратах поперечного среза семян должно быть видно, что верхний эпидермис состоит из палисадоподобных клеток, стенки которых пронизаны поровыми канальцами; наружные стенки клеток утолщены сильнее боковых. Сверху эпидермис покрыт тонким слоем кутикулы. Основная часть семенной кожуры представлена паренхимной тканью из клеток с утолщенными стенками. Клетки наружных рядов ее плотносомкнутые, а более глубоких – рыхлые с крупными межклетниками разнообразной формы (рыхлая паренхима). По направлению к зародышу клетки паренхимы мельчают и спадаются, образуя слой сдавленных клеток, в котором находятся проводящие пучки. Глубже располагается слой из 4-5 рядов крупных продолговатых клеток паренхимы с тонкими стенками и темно-коричневым содержимым. Самый внутренний слой семенной кожуры (остаток эндосперма) в виде тонкой пленки из деформированных клеток. Эпидермис семядолей состоит из мелких клеток, ткань семядолей – из многоугольных плотносомкнутых паренхимных клеток, содержащих капельки жирного масла и крахмальные зерна. Преобладают крупные крахмальные зерна неправильно грушевидной формы, мелкие зерна – простые и двух-трехсложные.

Сырьем для производства конского каштана обыкновенного экстракта сухого служат измельченные семена этого растения.

Для установления подлинности измельченных семян конского каштана обыкновенного методом микроскопии нами изучены несколько способов приготовления микропрепаратов. Один из них заключается в изучении под микроскопом поперечного среза наиболее крупных кусочков семян, находящихся в измельченном сырье (аналогично методике анализа цельного сырья). При этом микропрепарат должен соответствовать представленным выше описаниям. Второй метод, рекомендуемый ГФ XI для микроскопического и микрохимического исследования ЛРС, предусматривает исследование соскоба с наружной и внутренней части наиболее крупных кусочков среди аналитической пробы измельченных семян. При рассмотрении микропрепарата порошка соскоба в растворе хлоралгидрата или глицерина должны быть видны фрагменты покровных тканей, клетки паренхимы, проводящие пучки, остатки эндосперма и эпидермиса семядолей, крахмальные зерна, капли жирного масла, обрывки паренхимы с межклетниками.

Анализ дисперсного состава измельченных семян конского каштана показал, что фракция частиц, проходящих сквозь сито с отверстия диаметром 0,25 мм, составляет около 11%. На приготовлении микропрепарата из частиц именно этой фракции основана третья методика для установления подлинности измельчённого сырья конского каштана методом микроскопии.

















Рис. 1. Микропрепараты измельченных семян конского каштана

1 – клетки эпидермиса с поверхности кожуры (ув.×200); 2 – фрагмент поперечного среза эпидермиса кожуры (ув.×300); 3 – клетки губчатой паренхимы семянной кожуры (ув.×300); 4 – клетки паренхимы семядолей (ув.×300); 5 – фрагмент поперечного сечения семянной кожуры (ув.×111); 6 – проводящие пучки (ув.×300); 7 – клетки паренхимы семядолей (ув.×300); 8 – крахмальные зерна семядолей (ув.×1200) и

9 – капли жирного масла семядолей (ув.×1200)

Для этого из аналитической пробы сырья нужно отобрать навеску массой около 20 г, поместить и просеять её в течение 5 минут через набор сит с отверстиями размером 0,5 мм и 0,25 мм. Порошок на сите с отверстиями размером 0,25 мм используют для приготовления микропрепаратов. Аликвоту порошка шпателем поместить в стаканчик и прилить 2,5 % раствор NaOH, кипятить в течение 2 минут, а затем промыть водой. Далее небольшое количество порошка препаровальной иглой перенести на предметное стекло в каплю раствора хлоралгидрата, накрыть покровным стеклом и рассмотреть под микроскопом. Для установления наличия и свойств крахмальных зерен небольшую часть порошка следует внести в каплю воды. При просмотре нескольких микропрепаратов в воде должны быть видны: фрагменты паренхимы семядолей с плотносомкнутыми клетками, наполненными крахмальными зернами; крахмальные зерна неправильной грушевидной формы в группах и по отдельности и капли жирного масла. При просмотре нескольких микропрепаратов в растворе хлоралгидрата должны быть видны красно-коричневые, светло-коричневые фрагменты губчатой паренхимы семенной кожуры; серовато-белые фрагменты паренхимы семядолей; обрывки проводящих пучков; кусочки эпидермы семенной кожуры красно-коричневого цвета, состоящей из плотносомкнутых ячеистых клеток с прямыми стенками. Также могут в поле зрения попадаться и другие фрагменты семени (рис. 1).

Все вышеизложенные методики микроскопического анализа измельченного сырья конского каштана обыкновенного позволяют достоверно выявлять диагностические элементы анатомического строения семян конского каштана.

^ Установление подлинности семян конского каштана обыкновенного

В разделе «Качественные реакции» нового варианта ТУ предусмотрено проведение тестов на обнаружение ТГ. Для определения наличия эсцина была разработана методика ТСХ. Наилучшие результаты были получены при использовании в качестве подвижной фазы смесь растворителей: этилацетат – изопропанол – вода (40:40:30), а в качестве проявителя хроматограммы 25 % спиртового раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты. Пятна на хроматограммах испытуемых объектов оценивали в сравнении со стандартным образцом эсцина (пятно фиолетового цвета с Rf около 0,71).

      Разработка методики количественного определения ТГ в сырье

С учетом современных требований к анализу БАС, для количественной




I. Эсцин Ia: R1=T*, R2=-COCH3, R3=-H

II. Эсцин Ib: R1= A**, R2= -COCH3, R3=-H

III. Изоэсцин Ia: R1=T*, R2 =-H, R3=-COCH3

IV. Изоэсцин Ib: R1=A**, R2= -H, R3 =-COCH3




*Tigloyl **Angeloyl



Рис. 2. Доминирующие компоненты эсцина

оценки суммы ТГ конского каштана обыкновенного разработана методика определения содержания суммы четырех основных гликозидов (эсцин Ia и Ib, изоэсцин Ia и Ib), которые мы условно называем «эсцином» (рис. 2), методом ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектором с использованием эсцина-стандартного образца.

В основу методики положены следующие условия хроматографирования: длина волны (λ) – 210 нм (рис. 3), неподвижная фаза – С18, колонка Waters Symmetry C18 250х4,6 мм, США, лучшими показателями разделения и стабильностью отличалась система состава: компонент А: буферный раствор о-фосфорной кислоты с рН=2,5; компонент В: ацетонитрил в условиях градиентного элюирования. Форма градиента линейная:

Время, мин

А, %

В, %

0

95

5

30

40

60

32

5

95

40

5

95

Наилучшее разделение ТГ наблюдалось при температуре термостата колонки 35 °С, скорости потока подвижной фазы 1 мл/мин. Объем вводимой пробы 10 мкл.



Рис. 3. УФ-спектр поглощения спиртового раствора эсцина-стандартного образца.




Рис. 4. ВЭЖ-хроматограмма раствора эсцина-стандартного образца: 1, 2, 3, 4 – эсцин Ia, эсцин Ib, изоэсцин Ia, изоэсцин Ib.


Хроматографическое разделение эсцина-стандартного образца представлено на рис. 4.

^ Условия пробоподготовки. Максимальный уровень эсцина в извлечении наблюдался при экстрагировании семян, измельченных до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5 мм, 70 % этанолом на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 30 минут после предварительной обработки ультразвуком в течение 10 минут и соотношении сырья к экстрагенту 1:100. Типовая ВЭЖХ хроматограмма извлечения семян конского каштана обыкновенного представлена на рис. 5.



Рис. 5. ВЭЖ-хроматограмма извлечения из семян конского каштана обыкновенного: 1, 2, 3, 4 – эсцин Ia, эсцин Ib, изоэсцин Ia, изоэсцин Ib.



Содержание ТГ (X, %) определяют методом абсолютной калибровки или по формуле:

, где

С – концентрация эсцина-стандартного образца, мг/мл; S1 – суммарная площадь пиков, соответствующая эсцину-стандарту, мм2; S2 – суммарная площадь пиков, соответствующая эсцину испытуемого образца, мм2; V – объем испытуемого образца, мл; m – масса навески сырья, мг.

Содержание ТГ в семенах конского каштана обыкновенного в пересчете на безводное вещество должно быть не менее 4 %.

        Валидация методики ВЭЖХ количественного определения эсцина

Основным критерием специфичности является степень разделения - Rs, определяющаяся на основе показателей пригодности хроматографической системы.

Для проверки пригодности хроматографической системы использовался раствор эсцина-стандартного образца. Расчет параметров хроматографической системы проводился для пиков эсцина на 5 хроматограммах, полученных в условиях анализа извлечения из семян конского каштана обыкновенного. Результаты представлены в таблице 1.

^ Прецизионность (воспроизводимость) методики характеризовалась величиной стандартного отклонения S (0,1976) или относительным стандартным отклонением RS (4,29 %) для серии измерений на примере одного образца сырья в 10 независимых повторностях.

Таблица 1

Параметры разделения основных компонентов эсцина

в условиях градиентного элюирования

Пики

Время удерживания, tR, мин

Коэффи-циент асимметрии пика, As

Коэффи-циент емкости, K

Число теоретических тарелок, N

Селективность, α

Степень разделения, Rs

1

26,4

1,1

12,1

965

0,97

0,7

2

26,9

1,1

12,5

1002

0,99

1,05

3

27,2

1,1

12,6

1025

0,95

1,15

4

27,7

1,1

13,2

1063

1,05

Метрологические характеристики методики определения содержания эсцина приведены в таблице 2.

Таблица 2

Метрологические характеристики методики количественного определения эсцина

в семенах конского каштана обыкновенного

F

X

S2

S

P,%

T(f,P)

∆Xср

E, %

9

4,601

3,904 * 10-2

0,1976

95

2,78

0,1732

±3,76

Относительная ошибка единичного определения методики количественного определения эсцина с 95 % вероятностью составляет ±3,76 %.

Линейность исследовалась на растворе эсцина-стандартного образца (таблица 3, рисунок 6).

Таблица 3

Параметры разделения сапонинов в условиях градиентного элюирования,

скорость подвижной фазы 1 мл/мин, мертвый объем t0=2,1

в семенах конского каштана обыкновенного

Соединение

Параметры линейности

Коэффициент корреляции

Диапазон линейных концентраций, мг/мл

Уравнение регрессии или уравнение сглаживающей прямой (а = 320,95; b = 0,086 с прибора)

Эсцин

0,02-0,2

S = 320,95*C + 0,086 

0,9998




Рис. 6 Калибровочный график раствора эсцина-стандартного образца.


На основании полученных результатов можно утверждать, что соблюдается линейная зависимость между величинами площадей хроматографических пиков и содержанием эсцина в рабочем интервале, который можно определить как аналитическую область методики.

^ Точность (правильность) методики показывает систематические погрешности метода. Для проверки отсутствия систематической ошибки методики были поставлены эксперименты с добавками эсцина непосредственно к сырью перед началом экстракции (таблица 4).

Таблица 4

Результаты опытов с добавками эсцина в навеску сырья

Найдено эсцина в сырье, г

Добавлено

эсцина, г

Должно быть, г

Найдено, г

Относительная ошибка, %

0,0460

0,0051

0,0511

0,0507

- 0,78

0,0463

0,0042

0,0505

0,0510

+ 0,99

0,0461

0,0055

0,0516

0,0508

- 1,55

^ Диапазон применения методики составляет для количественного определения сырья от 80 % до 120 %.

По результатам валидации установлено, что приведенная методика является специфичной для определения содержания эсцина в сырье конского каштана обыкновенного, характеризуется корректной точностью и воспроизводимостью, линейной зависимостью, что позволяет использовать ее для достоверной оценки качества семян конского каштана обыкновенного.

^ Разработка нормативной документации

на семена конского каштана обыкновенного

В результате анализа 5 опытных партий высушенного сырья конского каштана обыкновенного установлены нормы его числовых показателей: содержание эсцина не менее 4 %; влажность не более 12 %; содержание золы общей не более 2,5 %; содержание золы, нерастворимой в 10 % растворе кислоты хлористоводородной, не более 2 %; содержание других частей растения (околоплодника, плодоножек, веточек, листьев), в том числе отделенных при анализе, не более 0,5 %; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 3 мм не более 1 %, содержание органической примеси не более 3 % и минеральной примеси не более 0,5 %, микробиологическая (по ОФС 42-0016-04) и радиоактивная (по ОФС 41-001-03) чистота.

На основании проведенных исследований зарегистрирован и утвержден в ВИЛАР новый вариант технических условий ТУ 9377-075-04868244-2008 «Семена конского каштана обыкновенного».

Установлен срок годности сырья – 3 года.

^ Фитохимическое изучение семян конского каштана обыкновенного

Изучение качественного и количественного состава

некоторых групп БАС семян

По результатам проведенного фитохимического анализа в соответствии с данными литературы в семенах установлено наличие следующих групп БАС: ТГ (эсцин), флавоноидов и кумаринов, полисахаридов, моно- и дисахаридов, свободных аминокислот, липидов.

Изучение содержания эсцина проводили описанными ранее методиками ТСХ и ВЭЖХ.

Гравиметрическим методом по ГФ XI (вып. 2, С. 264-267) в семенах конского каштана обыкновенного установлено 41,62 % полисахаридов.

При хроматографировании в системе (хлороформ-метанол-вода, 26:14:3), на пластинках силуфола или сорбфила, с последующей обработкой раствором диазобензолсульфокислоты или 20 % спиртовым раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты, а также при просмотре хроматограмм в УФ-свете при длине волны 366 нм и 254 нм обнаруживаются пятна с Rf 0,91 (фраксин); 0,86 (эскулин), 0,4 (рутин).

Идентификацию и количественное определение моно- и дисахаридов семян конского каштана обыкновенного проводили методом ВЭЖХ, используя внешние стандарты. Установлено, что семена конского каштана обыкновенного содержат фруктозу (0,3 %), глюкозу (0,32 %) и сахарозу (6,36 %); галактозы, рибозы и ксилозы не найдено (рисунок 6).



Рис. 6. ВЭЖ-Хроматограмма моно- и дисахаридов семян конского каштана

1 – фруктоза, 2 – глюкоза, 3 – сахароза

В связи с отсутствием в литературе сведений об аминокислотном составе семян конского каштана обыкновенного и значимости этой группы БАС нами исследован качественный состав и определено количественное содержание аминокислот методом ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией ортофталевым альдегидом в присутствии меркапто-пропионовой кислоты (OPA-реагент). Рассчет проводят методом абсолютной калибровки. Полученные результаты анализа свободных аминокислот в пересчете на сухое сырье приведены на рисунке 7 и в таблице 5.

Таким образом, обнаружено 15 аминокислот, из которых 5 (метионин, валин, лейцин, изолейцин, лизин) являются незаменимыми для организма человека. Преобладающими свободными аминокислотами по количественному содержанию являются треонин, аланин и аргинин, вдвое меньше содержится аспарагиновой и глутаминовой кислот, еще вдвое меньше которых лизин.

С целью изучения липофильных веществ семян конского каштана обыкновенного нами получено гексановое извлечение путем экстракции навески сырья (10 г) в аппарате Сокслета при температуре (40±5) ºС.




Рис. 7. ВЭЖ-Хроматограмма свободных аминокислот семян

конского каштана обыкновенного

Таблица 5

Характеристика ВЭЖ-хроматограммы свободных аминокислот

в семенах конского каштана обыкновенного



п/п

Аминокислоты

Время удерживания

Содержание аминокислоты в 100 г сырья, мг



5-гидрокситриптофан

9,02

-



Аланин

7,64

1,29



Аргинин

7,92

1,63



Аспарагин

3,72

-



Аспарагиновая кислота

1,35

0,67



Цитруллин

6,81

-



Цистин

10,92

0,26



Глутаминовая кислота

1,66

0,76



Глутамин

5,47

-



Глицин

5,97

0,03



Гистидина моногидрат

5,79

0,26



Изолейцин

13,06

0,16



Лейцин

13,71

0,16



Лизина гидрохлорид

14,43

0,36



Метионин

11,47

0,08



Орнитин

13,39

-



Фенилаланин

12,82

-



Пролин

17,89

-



Серин

4,85

0,23



Таурин

7,78

-



Треонин

6,33

1,45



Тирозин

9,61

0,19



Триптофан

12,61

-



Валин

11,23

0,25



^ Суммарное содержание




6,78

Гексановое извлечение упаривали под вакуумом, и полученный остаток (0,61 г) анализировали методами денситометрии и ГЭЖХ. Полученный остаток представлял собой маслянистую, легкоподвижную, мутную жидкость зеленовато-желтого цвета с коэффициентом преломления [1,4728]D22°С, относящуюсяся к полувысыхающим маслам.

Определение группового состава липидов семян проводили методом ТСХ на пластинках «Silufol» с закрепленным слоем силикагеля. Пластинку предварительно смачивают в 2%-ном растворе фосфорномолибденовой кислоты в ацетоне. На пластинку наносится около 10 мкг липидов в эфирном растворе в виде полосы длиной 10 мм. Проявление хроматограммы проводят в системе растворителей гексан: диэтиловый эфир: уксусная кислота – 80:30:1,5. Пластинку высушивают на воздухе до исчезновения запаха растворителей и помещают в шкаф с принудительной вентиляцией при температуре 80 °С до появления синих пятен отдельных групп липидов на желтом фоне. Идентификацию отдельных групп липидов проводят сравнивая значения Rf стандартных веществ с Rf пятен на хроматограмме.

Таблица 6

Групповой состав липофильных веществ семян

конского каштана обыкновенного

Наименование групп липидов

Содержание, %

Полярные липиды

0,7

Стерины

1,8

Свободные жирные кислоты

35,7

Триацилглицерины

58,5

Эфиры стеринов

3,3




Скачать 490,44 Kb.
оставить комментарий
страница1/3
Жарова Олеся Глебовна
Дата28.09.2011
Размер490,44 Kb.
ТипАвтореферат диссертации, Образовательные материалы
Добавить документ в свой блог или на сайт

страницы:   1   2   3
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Разместите кнопку на своём сайте или блоге:
rudocs.exdat.com

Загрузка...
База данных защищена авторским правом ©exdat 2000-2017
При копировании материала укажите ссылку
обратиться к администрации
Анализ
Справочники
Сценарии
Рефераты
Курсовые работы
Авторефераты
Программы
Методички
Документы
Понятия

опубликовать
Загрузка...
Документы

Рейтинг@Mail.ru
наверх