Эколого-генетическая оценка защитного эффекта аллантоина и мочевой кислоты в условиях окислительного стресса 03. 00. 16 экология 03. 00. 15 генетика icon

Эколого-генетическая оценка защитного эффекта аллантоина и мочевой кислоты в условиях окислительного стресса 03. 00. 16 экология 03. 00. 15 генетика


Смотрите также:
Роль окислительного стресса в патогенезе сосудистых осложнений сахарного диабета и применение...
Эколого-генетическая и эпидемиологическая оценка горных территорий Центрального Кавказа...
«Рэсбио»
Роль окислительного стресса...
Роль окислительного стресса в развитии и прогрессировании поздних осложнений сахарного диабета 2...
Лекция Нуклеиновые кислоты. Атф...
Молекулярно-генетическая природа первичных гемофагоцитарных лимфогистиоцитозов в россии 03. 02...
Прогноз биологической активности и токсичности тио(амино)алкилфенолов с помощью компьютерных...
«Защитные полосы как фактор повышения экологической безопасности и здоровья населения в аридных...
Пояснительная записка Изучение курса опирается на материалы следующих дисциплин...
«Экология вокруг нас»...
Полиморфные маркеры генов-кандидатов и генетическая предрасположенность к неблагоприятному...



Загрузка...
скачать
На правах рукописи



АЗАРИН КИРИЛЛ ВИТАЛЬЕВИЧ


эколого-генетическая оценка защитного эффекта аллантоина и мочевой кислоты в условиях окислительного стресса


03.00.16 – экология

03.00.15 – генетика


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Ростов-на-Дону

2009

Работа выполнена на кафедре генетики и в НИИ Биологии Южного федерального университета

Научные руководители:

доктор биологических наук, доцент

Усатов Александр Вячеславович;

кандидат биологических наук, ст. научн. сотр.

Чистяков Владимир Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Асланян Марлен Мкртичович

доктор биологических наук, доцент

Минкина Татьяна Михайловна


Ведущая организация:

Кубанский государственный университет,

г. Краснодар



Защита состоится “20” ноября 2009 г. в 1700 часов на заседании диссертационного совета Д 212.208.32 по биологическим наукам при Южном федеральном университете (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Б.Садовая, 105, ЮФУ, ауд. 304, e-mail: denisova777@inbox.ru, факс: (863)2638723).


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Южного федерального университета (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148) и на сайте Южного федерального университета: www.sfedu.ru


Автореферат разослан «19» октября 2009 г.


Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Т.В. Денисова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА работы

^ Актуальность темы. Загрязнение воды, воздуха, выпадение кислотных осадков, деградация почвы, увеличение интенсивности потока ультрафиолетовой радиации и как следствие общее нарушение экологического равновесия привели к тому, что живые организмы все в большей мере подвергаются прессингу широкого спектра экстремальных факторов среды. Исходя из вышеуказанного ясно, что помимо вопросов коррекции состояния окружающей среды, актуальной становиться и проблема повышения устойчивости организмов к этим экологическим факторам. Прикладная, на первый взгляд, проблема поиска методов защиты имеет и фундаментальный аспект. Более глубокое понимание механизмов толерантности к внешним воздействиям, характерных для организмов и экосистем, необходимо для прогнозирования последствий и их предупреждения, что особенно важно в связи с проблемой возможного увеличения генетического груза в условиях нарастающего антропогенного прессинга на природные популяции.

Общим следствием влияния большинства абиотических факторов (Polle and Rennenberg, 1993), в том числе таких широко распространенных как тяжелые металлы (Flora et al., 2008; Liu et al., 2009) и ультрафиолетовое излучение (Kovacs et al., 2009), на организмы является увеличение внутриклеточной концентрации активных форм кислорода (АФК). Поэтому, одна из возможных мер, снижения негативного действия этих факторов на организмы, может быть реализована через систему природных антиоксидантов, уменьшающих внутриклеточные концентрации АФК.

Одними из таких антиоксидантов со свойствами экологических протекторов могут быть продукты деградации пуринов, в частности, аллантоин и мочевая кислота. Так, в серии опубликованных ранее работ (Ames et al., 1981; Гуськов и др., 2002; 2004), сообщалось об обнаружении способности аллантоина и урата подавлять развитие деструктивных процессов, индуцируемых активными формами кислорода. Так же была показана способность аллантоина снижать уровень аберраций хромосом (Гуськов, 2004), что немаловажно для обеспечения защиты от воздействия экстремальных факторов, зачастую обладающих мутагенным эффектом. Активные формы кислорода могут также либо непосредственно индуцировать мутации, либо изменять чувствительность клеток к другим мутагенам (Guetens et al., 2002). Способность урата защищать нуклеиновые кислоты широко применяется на практике, это вещество входит в состав пропитки наиболее популярного «инструмента» консервации ДНК – FTА-карт.

^ Цель и задачи исследования. Целью работы является эколого-генетическая оценка защитного эффекта аллантоина и мочевой кислоты в условиях окислительного стресса.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

  1. Исследовать действие тяжелых металлов на растения подсолнечника и горчицы и определить уровень устойчивости к этому воздействию в присутствии природных антиоксидантов аллантоина и мочевой кислоты.

  2. Исследовать влияние аллантоина и урата на действие окислительного стресса, индуцированного гипербарической оксигенацией (ГБО), на подсолнечник Helianthus annuus L. и горчицу Brassica juncea Czern.

  3. Изучить при помощи бактериальных биосенсоров действие длинноволнового спектра ультрафиолета (300-400 нм), характерного для солнечного света у земной поверхности, и определить наиболее эффективные концентрации аллантоина и мочевой кислоты, супрессирующие его мутагенный эффект.

  4. Исследовать антимутагенную и супероксидустраняющую активности аллантоина и мочевой кислоты с помощью бактериальных биосенсоров и опытов in vitro.

  5. Провести сравнительный анализ влияния тяжелых металлов и протекторных свойств аллантоина и мочевой кислоты на внеядерные мутанты подсолнечника.

^ Научная новизна полученных результатов. Впервые проведен сравнительный анализ устойчивости растений к воздействию тяжёлых металлов в присутствии природных антиоксидантов – аллантоина и урата. Исследовано воздействие ультрафиолета с длиной волны 300-400 нм на бактериальной модели и определена зависимость величины антимутагенной активности аллантоина от его концентрации. Предложена экспериментально обоснованная модель протекторных свойств аллантоина и урата от рассмотренных экологических факторов. Впервые исследовано влияние ядра и цитоплазматических генов на устойчивость растений подсолнечника Helianthus annuus L. к действию тяжелых металлов.

Практическая значимость работы. Полученные результаты позволят расширить и систематизировать современные представления о влиянии таких абиотических факторов как тяжелые металлы и ультрафиолетовое излучение. Выявленный фотопротекторный эффект аллантоина может быть использован для повышения эффективности солнцезащитных смесей.

Информация о повышении устойчивости растений к действию тяжёлых металлов в присутствии аллантоина и урата может быть использована в биотехнологическом процессе получения новых форм – аккумуляторов тяжелых металлов для фиторемедиации загрязненных почв.

Материалы диссертации включены в состав учебных материалов для занятий студентов биолого-почвенного факультета Южного федерального университета по специальным курсам кафедры генетики и могут быть использованы в учебном процессе в других вузах.

^ Основные положения, выносимые на защиту:

  • Пуриновые катаболиты – урат и аллантоин являются эффективными протекторами от действия тяжелых металлов на растения.

  • Аллантоин подавляет мутагенный эффект ультрафиолета с длиной волны 300-400 нм.

  • Аллантоин и урат снижают негативное действие окислительного стресса на растения.

  • Внеядерные мутации подсолнечника приводят к повышению устойчивости растений к действию тяжелых металлов.

^ Апробация работы. Результаты исследования и основные положения диссертации были представлены и обсуждены на Международной конференции «International interdisciplinary workshop and scientific discussion club IW+SDC’06» (Bangkok – Pattaya, Thailand, 2006); Международной научно-практической конференция «Вавиловские чтения - 2007» (Саратов, 2007); III Международной научно-практической конференции «Урбоэкосистемы. Проблемы и перспективы развития» (Ишим, 2008); Международном научно-практическом симпозиуме «Свободнорадикальная медицина и антиоксидантная терапия» (Волгоград, 2008); IV Международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов» (Крым, 2008); XV Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2008); Международной научно-практической конференции «Современная экология - наука XXI века». (Рязань, 2008); II Международной научно-практической конференции «Проблемы биологии, экологии, географии, образования: история и современность» (СПб., 2008); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); II-м Санкт-Петербургском международном экологическом форуме «Окружающая среда и здоровье человека» (Санкт-Петербург, 2008); II всероссийском с международным участием конгрессе «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009).

^ Публикация материалов исследования. По теме диссертации опубликовано 18 работ, объёмом 2,9 п.л., из них 5 в изданиях, рекомендованных ВАК, получен один патент. Доля участия автора в публикациях составляет 80% (2,3 п.л.).

^ Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 131 странице, содержит 17 рисунков и 33 таблицы. Список цитируемой литературы включает 169 источника, из них 146 на иностранных языках.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства науки и образования РФ (гранты «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 гг.)» № 2.1.1/5628 и № 2.1.1/4947).

^

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ


В сериях лабораторных экспериментов по оценке устойчивости организмов, в присутствие аллантоина и урата, к воздействию солей тяжёлых металлов (Cd++, Pb++, Fe++ и Cu++) использовали семена растений горчицы Brassica junceae Czern и подсолнечника Helianthus annuus L. Инбредная линия 3629 подсолнечника Helianthus annuus L была выведена А.И. Гундаевым в 1959 г. из среднеспелой высокомасличной популяции ВНИИМК 20044. Семена сортовых растений горчицы Лера получена от автора сорта В.Г. Картамышева (Донская опытная станция масличных культур им. Л.А. Жданова, ВНИИМК). Семена проращивали в водных растворах солей тяжелых металлов, аллантоина и урата в различных концентрациях. Каждый опыт проводили в трёх независимых повторах, по 40 семян в каждом из повторов. Степень действия тяжёлых металлов и протекторные свойства антиоксидантов оценивали по степени подавления корневого роста и выживаемости растений через 72 ч прорастания семян.

Для исследования влияния ядра и цитоплазматических генов на устойчивость растений к действию тяжелых металлов из коллекционного материала хлорофилльных мутантов подсолнечника НИИ биологии ЮФУ были отобраны следующие линии: исходная инбредная линия 3629, полученные на её основе хлорофильные пластомныйе мутанты en:clorina-3, en:clorina-5, en:clorina-7 и зеленый ревертант r-en:clorina-7 с изменённой структурой митохондриальной ДНК (Разорителева и др., 1995; Triboush et al., 1999; Усатов и др., 2004).

Антимутагенную активность исследованных соединений in vivo оценивали по способности подавлять индуцированный ультрафиолетом и перекисью водорода SOS-ответ клеток E.coli. В качестве системы для оценки воздействия был применен вариант SOS-lux теста (Сазыкина и др., 2002). Измерения интенсивности биолюминесценции культур проводили на люминометре ЛТ-01.

Культуры E.coli облучали ультрафиолетовым светом с длиной волны 300-400 нм на специальной установке, использующей в качестве излучателя ртутную лампу низкого давления (HG-125). Культуры облучали сублетальной дозой 390 Дж/м2, инкубировали при 25оС в течение 120 минут для развития SOS-ответа. Растворы исследуемых протекторов в дистиллированной воде добавляли до необходимой конечной концентрации за 30 мин до облучения. Оптимальность данного режима обработки обоснована в публикации (Чистяков и др., 2009).

Окислительный стресс моделировали гипербарической оксигенацией (ГБО) в режиме 0,7 МПа чистого кислорода в течение первых 10 ч прорастания семян растений сразу после замачивания. Обработанные и контрольные проростки высевали в поле в оптимальные сроки по типу селекционного питомника на 10-метровых делянках с площадью питания 40-60 см. В качестве критерия устойчивости в полевых опытах определяли всхожесть проростков и высоту растений горчицы и подсолнечника на стадии 3 – 4-й пары листьев.

Хемилюминесцентный анализ проводили на приборе AutoLumat Plus LB 953 фирмы Berthold Technologies в системе H2O2-люминол (5-амино-2,3дигидрофталазидион-1,4). Динамику метаболических изменений оценивали по интенсивности быстрой вспышки и светосуммы хемилюминесценции.

Для определения способности аллантоина и мочевой кислоты подавлять генерацию О2·­ использовали разработанную ранее методику (Чистяков и др., 2005). Данные по супероксидустраняющей активности представляли в виде единиц активности супероксиддисмутазы, рассчитанных согласно Фридовичу (Imlay, Fridovich, 1991).

В таблицах представлены средние арифметические и их стандартные ошибки. Каждый опыт проводили в трёх независимых повторах. Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием t-критерия Стьюдента (Лакин, 1990).


^ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Протекторный эффект аллантоина и мочевой кислоты при действии тяжелых металлов на прорастающие семена растений.

В результате проведенных нами исследований было установлено, что исследуемые азотистые катаболиты в концентрациях 10-3 и 10-4 М не оказывают значительного влияния на скорость роста корешков горчицы.

Исследование длины корешков и всхожести семян горчицы под воздействием тяжелых металлов и в присутствие природных антиоксидантов аллантоина и мочевой кислоты, показало достоверное снижение негативного действия тяжёлых металлов. Так проращивание семян горчицы в присутствие соли меди в концентрации 50 мкМ и аллантоина в концентрации 10-3 М увеличивает длину корешка с 37% от контроля (в присутствие только сульфата меди) до 86% относительно контроля. Более того, внесение урата в концентрации 10-3 М полностью нивелирует токсические процессы, вызванные воздействием меди (рис. 1).



Рис. 1. Длина корешков через 72 ч прорастания семян горчицы при действии различных концентраций сульфата меди и аллантоина и урата в концентрации А – 10-3 и В – 10-4 М.

При увеличении концентрации соли меди до 1000 мкМ, аллантоин не показывает достоверного снижения последствий воздействия тяжёлого металла. Урат, в свою очередь, в концентрации 10-3 М демонстрирует увеличение воздействия меди, что выражается в снижение скорости корневого роста (P < 0,05).

Сходное воздействие с сульфатом меди на скорость прорастания семян оказали ионы другого переходного металла – железа (рис. 2).



Рис. 2. Длина корешков через 72 ч прорастания семян горчицы при действии сульфата железа в концентрации 1000 мкМ и аллантоина и урата в концентрации 10-4 – 10-3 М.

Для проростков горчицы эффективной концентрацией кадмия является 50 мкМ соли данного вещества, при этом подавление скорости прорастания семян происходит более чем в четыре раза.



Рис. 3. Длина корешков через 72 ч прорастания семян горчицы при действии сульфата кадмия в концентрации 50 мкМ и аллантоина, урата в концентрации 10-4 – 10-3 М.

При прорастании семян в присутствие природных антиоксидантов – аллантоина и урата происходит, в среднем, одинаковое снижение последствий воздействия тяжёлого металла на длину корешков горчицы (рис. 3).

Наибольший протекторный эффект от воздействия свинца показал урат в концентрации 10-4 М; длина корешка проростков горчицы при этой концентрации природного антиоксиданта достигает 90% длины корешков в контрольных пробах.

Исследование протекторного эффекта пуриновых катаболитов при действии солей тяжёлых металлов на прорастающие семена подсолнечника показало сходные результаты.

^ Анализ хемилюминесценции. При высоком содержании меди при проращивании семян горчицы и подсолнечника все параметры H2O2-люминол-индуцированной хемилюминесценции достоверно превышали показатели в контрольной группе. В присутствие аллантоина и урата показатели H2O2-люминол-индуцированной хемилюминесценции приблизительно в 2 раза ниже исходных значений, индуцированных солями меди.

Исследуемые антиоксиданты, также, значительно снижали показатели светосуммы хемилюминесценции и максимальной интенсивности быстрой вспышки, индуцируемые ионами железа.

Таблица 1. Влияние аллантоина и урата на интенсивность H2O2-люминол-индуцированной хемилюминесценции в тест системе корешков горчицы при индуцированном сульфатом меди окислительном стрессе




Контроль

CuSO4

(50 мкM)

CuSO4 + аллантоин

(10-3 М)

CuSO4 + урат (10-3 М)

Максимальная быстрая вспышка

7,86 × 105 ± 0,01 × 105

22,25 × 105 ± 0,4 × 105 *

9,76 × 105 ± 0,044 × 105 **

10,51 × 105 ± 0,51 × 105 **

Светосумма

4478,6 × 105 ± 104 × 105

12051,6 ×105 ± 451 × 105 *

5191,6 × 105 ± 477 × 105 **

4900,9 × 105 ± 80 × 105 **

Примечание: * Отличия от контроля статистически достоверны, P < 0,001.

** Отличия от действия только сульфата меди статистически достоверны, P < 0,001.

Непереходные металлы, рассмотренные в данном исследовании, также увеличивали параметры H2O2-люминол-индуцированной хемилюминесценции. Более высокими показателями светосуммы хемилюминесценции и максимальной интенсивности быстрой вспышки при меньшей эффективной концентрации характеризуется воздействие на растения горчицы кадмия (табл. 2).

При этом также как в случае исследования подавления скорости корневого роста, аллантоин и урат, в среднем, одинаково снижали последствия воздействия тяжёлого металла выявленные в увеличении интенсивности H2O2-люминол-индуцированной хемилюминесценции (табл. 2).

Таблица 2. Влияние аллантоина и урата на интенсивность H2O2-люминол-индуцированной хемилюминесценции в тест системе корешков горчицы при индуцированном сульфатом кадмия окислительном стрессе




Контроль

CdSO4

(50 мкM)

CdSO4 + аллантоин (10-3 М)

CdSO4 + урат (10-3 М)

Максимальная быстрая вспышка

7,86 ×105 ± 0,01 ×105

14,14 × 105 ± 0,27 ×105 *

8,14 × 105 ± 0,58 ×105 **

8,39 × 105 ± 0,43 ×105 **

Светосумма

4478,6 ×105 ± 104 ×105

6112,1 ×105 ± 209 ×105 *

4800,8 ×105 ± 263 ×105 **

4360,7 ×105 ± 349 ×105 **

Примечание: * Отличия от контроля статистически достоверны, P < 0,001.

** Отличия от действия только сульфата кадмия статистически достоверны, P < 0,001.

Таким образом, по результатам модельного эксперимента по воздействию тяжелых металлов на прорастающие семена горчицы и подсолнечника, показано, что аллантоин и урат повышают устойчивость растений к неблагоприятным условиям.

^ Влияние ГБО на проростки растений и протекторные свойства пуриновых катаболитов. В результате проведенных нами исследований по действию ГБО на растения было установлено, что происходит ингибирование ростовых процессов и снижение всхожести. В тоже время исследуемые азотистые катаболиты понижали негативное действие ГБО (табл. 3,4).

Таблица 3. Всхожесть и высота растений горчицы (см) на стадии 3 – 4-й пары листьев после воздействия повышенным давлением кислорода




Контроль

ГБО

ГБО + аллантоин (10-3 М)

ГБО + аллантоин (10-4 М)

ГБО + урат

(10-3 М)

ГБО + урат

(10-4 М)

Высота растений

5,2 ± 0,11

2,9 ± 0,5*

3,9 ± 0,07 **

4,0 ± 0,2 **

3,9 ± 0,06 **

4,5 ± 0,16 **

Всхожесть семян

75%

50% +

74% ++

60%

78% ++

68%

Примечание: добавление антиоксидантов за 3 часа до ГБО

* Отличия от контроля статистически достоверны, P < 0,001; + P < 0,05.

** Отличия от действия только ГБО статистически достоверны, P < 0,001; ++P < 0,05.


Таблица 4. Всхожесть семян и высота растений подсолнечника (см) на стадии 3 – 4-й пары листьев после воздействия повышенным давлением кислорода




Контроль

ГБО


ГБО + аллантоин (10-3 М)

ГБО + аллантоин (10-4 М)

ГБО + урат

(10-3 М)

ГБО + урат

(10-4 М)

Высота растений

8,3 ± 0,21

6,2 ± 0,3*

7,6± 0,08 ++

6,7 ± 0,46

7,3± 0,09 ++

6,7 ± 0,33

Всхожесть семян

77%

27% *

50% ++

53% ++

60% **

55% ++

Примечание: добавление антиоксидантов за 3 часа до ГБО.

*^ Отличия от контроля статистически достоверны, P < 0,001; + P < 0,05.

** Отличия от действия только ГБО статистически достоверны, P < 0,001; ++P < 0,05.

В связи с этим можно заключить, что аллантоин и урат являются эффективными протекторами, проявляющими компенсаторные свойства недостаточности защитных механизмов растений, вызванных действием гипероксии.

^ Супрессия аллантоином и мочевой кислотой мутагенного эффекта ультрафиолета. На рисунке 4 показаны результаты действия аллантоина на индуцированный ультрафиолетом 300-400 нм SOS-ответ клеток E.coli. В ходе экспериментов мы определили, что аллантоин проявляет антимутагенную активность в диапазоне концентраций от 10-7 М до 10-4 М.

Статистически значимой протекторной активности урата в использованной экспериментальной модели не обнаружено. Концентрации 10-9, 10-8 М усиливают генотоксичность исследованного излучения.





Рис. 4. Зависимость степени супрессии мутагенной активности ультрафиолета (300-400 нм) от концентрации аллантоина.


Антимутагенная активность аллантоина и урата. В таблице 5 приведены результаты действия урата и аллантоина на индуцированный перекисью водорода SOS-ответ клеток E.coli.

Таблица 5. Индукция SOS-ответа E. coli перекисью водорода в присутствии урата, аллантоина


Концентрация, M


Урат


Аллантоин




Антимутагенная активность, %

Фактор

индукции, усл. единицы

Антимутагенная активность, %

Фактор

индукции, усл. единицы

0

0

100 ± 1

0

100 ± 9,5

10-11

-7

107 ± 23,2

40

60 ± 6,1

10-10

18

82 ± 5,1

74

26 ± 1,6

10-9

23

77 ± 1,4

73

27 ± 1,4

10-8

62

38 ± 3,4

75

25 ± 1,6

10-7

65

35 ± 4,4

80

20 ±3,1

10-6

40

60 ± 5

84

16 ± 2,3

10-5

49

52 ± 1,7

85

15 ± 1,5

10-4

66

34 ± 5,2

93

6 ± 2,0

10-3

68

32 ± 6,8

64

36 ± 3,9


Видно, что урат, также как и аллантоин, проявляет антимутагенную активность практически во всех вариантах опыта. Однако, в отличие от урата, аллантоин проявляет активность и при малых концентрациях.

Таким образом, мочевая кислота и аллантоин, вносят вклад в общий антиоксидантный пул метаболизма, величина которого имеет важнейшее адаптивное значение.

^ Анализ супероксидустраняющей активности. В таблице 6 приведены результаты по СУА аллантоина и мочевой кислоты. Для аллантоина увеличение концентрации не приводит к достоверному росту СУА, тогда как для урата обнаружена явная зависимость эффекта от дозы. Максимальное значение супероксидустраняющей активности зарегистрировано для урата в концентрации 10-5 М. Это указывает на значительную роль мочевой кислоты в качестве клеточного протектора от активных форм кислорода, таких как супероксид-анион.

^

Таблица 6. Супероксидустраняющая активность аллантоина и урата


Концентрация, M

Супероксидустраняющая активность урата, усл. единицы

Супероксидустраняющая активность аллантоин, усл. единицы

10-11

0,087 ± 0,011

0,088 ± 0,012

10-10

0,060 ± 0,019

0,058 ± 0,0035

10-9

0,084 ± 0,012

0,069 ± 0,004

10-8

0,224 ± 0,016

0,089 ± 0,0024

10-7

0,309 ± 0,013

0,129 ± 0,012

10-6

0,339 ± 0,013

0,181 ± 0,011

10-5

0,401 ± 0,010

0,171 ± 0,0025

10-4

0,029 ± 0,007

0,137 ± 0,018


^ Анализ влияния ядра и цитоплазматических генов на устойчивость растений к действию тяжелых металлов. Адаптивный потенциал растительной клетки определяется тремя генетическими системами: ядерными, хлоропластными и митохондриальными генами, которые, с одной стороны, могут повреждаться при действии экстремальных факторов, а с другой стороны являются активными участниками стресс-реакции; могут определять резистентность или ее отсутствие к действию внешних неблагоприятных факторов (Atak et al., 2004; Rosellini et al., 2004). Мутации в хлоропластной ДНК способны изменять чувствительность растительного организма к различным стрессорным воздействиям. В этой связи для исследования воздействия тяжелых металлов были выбраны из коллекции НИИ биологии ЮФУ линии подсолнечника, отличающиеся по цитоплазматическому геному (рис. 5). Выбор объектов был не случайным, так как ранее в серии исследований была показана устойчивость данных пластидных мутантов к ряду экстремальных факторов (Гуськов и др., 2001; Машкина и др., 2005).



1 – 3629; 2 – en:clorina-3; 3 – en:clorina-5; 4 – en:clorina-7; 5 – r-en:clorina-7.

Рис. 5. Всхожести и длина корешков через 72 ч прорастания семян подсолнечника в % от контроля после воздействия сульфата меди и сульфата кадмия в концентрации 50 мкМ .

Хлорофильные мутанты проявили большую устойчивость по сравнению с исходной линией 3629.

Сравнительное молекулярно-генетическое исследование хлДНК и мтДНК изучаемого ревертанта и его исходных форм (инбредной линии 3629, пластомного хлорофилльного мутанта en:clorina-7) показало ранее, что у ревертанта r-en:clorina-7 произошла истинная реверсия в хлоропластном геноме (Triboush et al., 1999).

Ревертант характеризуется большей скоростью прорастания семян, чем линия 3629 (рис. 6, 7).



Рис. 6. Длина корешков через 72 ч прорастания семян подсолнечника линии 3629 при действии сульфата меди в концентрации 50 мкМ и аллантоина, урата в концентрации 10-3 М.



Рис. 7. Длина корешков через 72 ч прорастания семян подсолнечника ревертанта r-en:clorina-7 при действии сульфата меди в концентрации 50 мкМ и аллантоина, урата в концентрации 10-3 М

При исследовании показателей интенсивности H2O2-люминол-индуцированной хемилюминесценции семян подсолнечника выявлены следующие закономерности. В результате действия меди на проростки подсолнечника линии 3629 происходит значительное снижение значений максимальной интенсивности быстрой вспышки и светосуммы хемилюминесценции. При воздействии меди на ревертант r-en:clorina-7 эти показатели повышаются. В результате действия соли меди совместно с исследуемыми пуриновыми катаболитами произошли существенные сдвиги в показателях H2O2-люминол-индуцированной хемилюминесценции. Так, у линии 3629 исходно с низкой, после воздействия меди, интенсивностью H2O2-люминол-индуцированной хемилюминесценции все изученные параметры повысились и приблизились к контрольным значениям. Наибольшее воздействие при этом оказал аллантоин. У ревертанта r-en:clorina-7 с высокой, после воздействия меди, интенсивностью H2O2-люминол-индуцированной хемилюминесценции установлены следующие особенности: светосумма свечения и амплитуда быстрой вспышки снизились до уровня в контрольной группе под воздействием аллантоина, урат также уменьшает эти показатели, но они не достигают контрольных значений.

Хлорофилльный мутант en:clorina-7 характеризуется наименьшей скоростью прорастания семян (рис. 8) по сравнению с линией 3629 и ревертантом r-en:clorina-7, что хорошо согласуется с показателями габитуса для этих форм, описанными ранее (Усатов и др., 2004). Однако пластомный мутант en:clorina-7 наиболее устойчив к действию тяжелых металлов. По показателям интенсивности H2O2-люминол-индуцированной хемилюминесценции хлорофилльный мутант en:clorina-7 проявил наивысшие значения среди трёх форм подсолнечника, исследуемых в данной генетической модели.



Рис. 8. Длина корешков через 72 ч прорастания семян подсолнечника хлорофилльнго мутанта en:clorina-7 при действии сульфата меди в концентрации 50 мкМ и аллантоина, урата в концентрации 10-3 М

Исследование, прорастающих семян подсолнечника в присутствие кадмия, показало сходные закономерности.

Таким образом, на основе анализа результатов исследований можно заключить, что природные антиоксиданты аллантоин и урат повышают устойчивость организмов к воздействию тяжёлых металлов и ультрафиолетовому излучению, в первую очередь вследствие их способности поддерживать редокс-гомеостаз.

В результате исследования действия универсального индуктора окислительного стресса – гипербарической оксигенации на растения установлено, что аллантоин и урат являются эффективными протекторами, проявляющими компенсаторные свойства недостаточности защитных механизмов растений, вызванных действием гипероксии (табл. 3, 4).

Урат более эффективно, чем аллантоин, «перехватывает» супероксид-анион (табл. 6), но в меньшей степени инактивирует свободнорадикальные продукты, ответственные за ДНК-повреждающую активность перекиси водорода и мутагенный эффект ультрафиолета (рис. 4; табл. 5).

Участие пластид и митохондрий в контроле окислительно-восстановительного гомеостаза во многом формирует резистентность растений к действию факторов среды. Как ядерные, так и цитоплазматические мутации способны изменять норму реакции организма. В этой связи растения внеядерных мутантов подсолнечника Helianthus annuus L., явились эффективной моделью для исследования протекторных свойств аллантоина и урата в условиях стресса, вызванного действием тяжелых металлов. Устойчивость растений подсолнечника к действию тяжёлых металлов различается в зависимости от генетической линии (рис. 5, 6, 7, 8). Действие тяжёлых металлов на исходную линию 3629 активирует системы защиты растения, что выражается в значительном снижении интенсивности H2O2-люминол-индуцированной хемилюминесценции. При воздействии тяжелых металлов на пластомный хлорофилльный мутант en:clorina-7 и ревертант r-en:clorina-7 интенсивность хемилюминесценции повышается. Регистрируемая разница показателей является следствием некомпенсированной генерации АФК. Наивысшая устойчивость к действию тяжелых металлов показана у пластомного мутанта en:clorina-7. Компенсация низкой устойчивости к действию тяжёлых металлов у линии 3629 и ревертанта r-en:clorina-7 происходит за счет добавления аллантоина и урата, то есть увеличения общего антиоксидантного пула. Протекторный эффект аллантоина и урата при действии сульфата кадмия на скорость прорастания семян хлорофилльнго мутанта en:clorina-7 не обнаружен, что свидетельствует о более глубоком влиянии мутаций в геноме хлоропластов на адаптивный потенциал растительной клетки.

Естественные механизмы защиты растений также могут быть связаны с действием катаболитов пуринов. Например, хорошо известно, что среди растений наивысшее содержание аллантоина имеет соя (Todd et al., 2006), часто называемая благодаря высокой урожайности «чудо-растением». Лекарственное растение окопник получило широкое распространение ввиду таких фармакологических свойств, как усиление процессов репаративной регенерации в тканях, также связанных с присутствием аллантоина (Grube et al., 2007). В этой связи можно говорить об экологической основе поиска новых лекарственных средств.

Таким образом, можно заключить, что аллантоин и урат являются эффективными экологическими протекторами от действия экстремальных факторов среды, опосредованных окислительным стрессом.

ВЫВОДЫ


1. Аллантоин и урат в миллимолярных (10-3 – 10-4 М) концентрациях значительно снижают негативное действие тяжелых металлов (Cd2+, Pb2+, Fe2+ и Cu2+) на растения, что выражается в приближении к контрольным значениям показателей выживаемости, скорости прорастания семян и интенсивности H2O2-люминол-индуцированной хемилюминесценции.

2. В результате исследования действия ГБО на растения было установлено, что аллантоин и урат в концентрации 10-3 М являются эффективными протекторами, проявляющими компенсаторные свойства недостаточности защитных механизмов растений, вызванных действием окислительного стресса.

3. В бактериальной тест-системе аллантоин в концентрации от 10-7 М до 10-4 М супрессирует мутагенный эффект ультрафиолета с длиной волны 300-400 нм, характерной для солнечного света у земной поверхности.

4. Протекторные свойства аллантоина и урата от действия абиотических факторов основаны на их антимутагеной и антиоксидантной активности, продемонстрированной на способности подавлять индуцированный перекисью водорода SOS-ответ клеток E.coli (in vivo) и подавлять генерацию супероксид аниона (in vitro). Максимальная антимутагенная активность урата (68%) регистрируется в концентрации 10-3 М. Максимальная антимутагенная активность аллантоина (93%) регистрируется в концентрации 10-4 М.

5. Показано, что мутации в цитогенах приводят к увеличению устойчивости прорастающих семян подсолнечника Helianthus annuus L к действию тяжёлых металлов. При воздействии как Cu2+, так Cd2+ наибольшую всхожесть и скорость роста, относительно соответствующих контролей, показал пластомный мутант en:clorina-7, а наименьшую – инбредная линия 3629.


^ СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Чистяков В.А., Азарин К.В., Усатов А.В. Антиоксидантный потенциал некоторых природных азотсодержащих соединений // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. – 2008. №5. С. 75-77. (40 % 0,3 п.л.).

2. Азарин К.В., Чистяков В.А., Усатов А.В. Супероксидустраняющая активность природных азотсодержащих соединений // Валеология. – 2008. №2. С. 38-43. (75 % 0,4 п.л.).

3. Азарин К.В., Чистяков В.А., Усатов А.В. Неферментативные механизмы контроля уровня активных форм кислорода // Валеология. – 2008. № 3. С. 68-73. (80 % 0,6 п.л.).

4. Шкурат Т.П., Ломтева С.В., Александрова А.А., Азарин К.В., Чистяков В.А. Роль аллантоина в процессах репродукции // Валеология. – 2008. № 4. С. 32-37. (20 % 0,2 п.л.).

5. Сазыкина М.А., Чистяков В.А., Коленко М.А., Азарин К.В. Аллантоин и урат как супрессоры генотоксического эффекта ультрафиолетового излучения длиной волны 300 – 400 нм // Экологическая генетика. – 2009. Т. VII. №2. С. 44-46. (25% 0,3 п.л.).

Патенты:

6. Чистяков В.А., Мирзоян А.В., Тимошкина Н.Н., Рынза Е.Т., Азарин К.В. Патент № 2352636. Способ хранения ДНК. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 20.04.2009г. (20 % 0,07 п.л.).

Статьи и тезисы в других изданиях:

7. Азарин К.В. Сопоставление антиоксидантной активности аллантоина и мочевой кислоты // Материалы международной научно-практической конференция, посвященной 120-летию Н. И. Вавилова «Вавиловские чтения - 2007». Саратов – 2007. С. 291-292. (100 % 0,06 п.л.).

8. Азарин К.В. Тяжёлые металлы как экотоксиканты и генераторы окислительного стресса // Вестник Российской военно-медицинской академии. Приложение 2 (ч. I). – 2008. Т. 3. №23. С. 62-63. (100 % 0,05 п.л.).

9. Азарин К. В. Факторы индукции окислительного стресса в условиях урбоэкосистемы и их влияние на здоровье человека // Материалы III международной научно-практической конференции «Урбоэкосистемы. Проблемы и перспективы развития». Ишим – 2008. С. 225-226. (100 % 0,06 п.л.).

10. Азарин К. В. Влияние аллантоина и урата на активность свободных радикалов в модельных системах // Материалы научно-практического симпозиума с международным участием «Свободнорадикальная медицина и антиоксидантная терапия». Волгоград – 2008. С. 3-4. (100 % 0,06 п.л.).

11. Азарин К. В. Молекулярная эволюция структуры гена, контролирующего синтез уратоксидазы // Материалы IV международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов». Крым – 2008. С. 34-36. (100 % 0,2 п.л.).

12. Азарин К. В. Молекулярно-генетические и биохимические основы действия тяжёлых металлов // Материалы XV всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии». Сыктывкар – 2008. Т. 3. С. 5-6. (100 % 0,06 п.л.).

13. Азарин К. В. Уменьшение повреждающего действия экотоксикантов неспецифическими агентами антиоксидантной системы. // Материалы международной научно-практической конференции «Современная экология - наука XXI века». Рязань – 2008. С. 171 – 173. (100 % 0,2 п.л.).

14. Азарин К. В. Тяжелые металлы как факторы индукции окислительного стресса и протекторные свойства некоторых природных азотсодержащих соединений // Материалы II международной научно-практической конференции «Проблемы биологии, экологии, географии, образования: история и современность». СПб. – 2008. С. 54-55. (100 % 0,06 п.л.).

15. Азарин К. В. Аллантоин и урат как часть антиоксидантной системы // Сборник трудов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск – 2008. С. 396. (100 % 0,05 п.л).

16. Азарин К. В. Влияние гипербарической оксигенации на проростки растений и протекторные свойства некоторых пуриновых катаболитов // Материалы II Всероссийского с международным участием конгресса «Симбиоз Россия 2009». Пермь – 2009. С 186-188. (100 % 0,2 п.л.).

17. Азарин К.В. Усатов А.В. Сравнительный анализ толерантности хлорофильных мутантов подсолнечника к действию тяжелых металлов // Материалы III международной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» Ростов-на-Дону. Изд-во ЮФУ, 2009. С. 63-64. (50 % 0,03 п.л.)

18. Guskov E.P., Lomteva S.V., Azarin K.V., Prokofev V.N. Role of allantoin in processes of the reproduction // International interdisciplinary workshop and scientific discussion club – “IW+SDC’06”. Bangkok – Pattaya, Thailand – 2006. P. 27. (25% 0,02 п.л.).


Список сокращений:

АФК – активные формы кислорода;

ГБО – гипербарическая оксигенация;

мтДНК – митохондриальная ДНК;

СУА – супероксид устраняющая активность;

хлДНК – хлоропластная ДНК.




Скачать 310.91 Kb.
оставить комментарий
Дата16.10.2011
Размер310.91 Kb.
ТипАвтореферат, Образовательные материалы
Добавить документ в свой блог или на сайт

Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Разместите кнопку на своём сайте или блоге:
rudocs.exdat.com

Загрузка...
База данных защищена авторским правом ©exdat 2000-2017
При копировании материала укажите ссылку
обратиться к администрации
Анализ
Справочники
Сценарии
Рефераты
Курсовые работы
Авторефераты
Программы
Методички
Документы
Понятия

опубликовать
Загрузка...
Документы

Рейтинг@Mail.ru
наверх