Учебно-методический комплекс по дисциплине «биотехнология растений» Учебно-методический комплекс Составитель: д б. н icon

Учебно-методический комплекс по дисциплине «биотехнология растений» Учебно-методический комплекс Составитель: д б. н


2 чел. помогло.
Смотрите также:
Учебно-методический комплекс по дисциплине «Экология растений» Учебно-методический комплекс...
Учебно-методический комплекс по дисциплине «биотехнология» Учебно-методический комплекс...
Учебно-методический комплекс по дисциплине Cпециальность 050102 Биология Квалификация учитель...
Учебно-методический комплекс по дисциплине «Инновационный менеджмент» Учебно-методический...
Учебно-методический комплекс по дисциплине дс. 02. 1...
Учебно-методический комплекс по дисциплине Теоретические основы прогрессивных технологий (физика...
Учебно-методический комплекс по дисциплине землеведение учебно-методический комплекс...
Учебно-методический комплекс по дисциплине «материаловедение» Учебно-методический комплекс...
Учебно-методический комплекс по дисциплине «материаловедение» Учебно-методический комплекс...
Учебно-методический комплекс по дисциплине «материаловедение» Учебно-методический комплекс...
Учебно-методический комплекс по дисциплине «современные средства оценивания результатов...
Учебно-методический комплекс по дисциплине «история техники» Учебно-методический комплекс...



Загрузка...
страницы: 1   2   3   4
вернуться в начало
скачать
Часть 1. Структура и свойства белковых молекул.


Вопрос о том, какие молекулы являются самыми важными для клетки, может быть некорректным. Однако, если вспомнить определение жизни, данное Ф. Энгельсом: «Жизнь – способ существования белковых молекул», становится очевидным, что белки являются, на наш взгляд, одними из самых «главных» молекул в клетке. Белки состоят из 20 аминокислот (АМК), которые соединяются между собой пептидной связью (рис. 31-32).

Количество и порядок чередования АМК определяют индивидуальность белка, а значит и формы существования живой материи (виды).





Рисунок 31. Структура и свойства аминокислот.




Рисунок 32. Схема образования белковой молекулы из аминокислот.










Рисунок 33. Формирование альфа-спирали вторичной структуры белка (слева) и схематическое изображение участка белковой молекулы (в центре). Третичная структура изображена третьим рисунком. Четвертичная структура гемоглобина – справа. Зеленые участки – специфические остатки. Зеленая прерывистая линия – водородные связи.


Таблица 8. Основные функции белков


Функции

Класс

Пример

Действие, локализация

Структурная

Фибриллярные. Арабиногалактаны

Кератин, коллаген. Арабиногалактаны растений

Волосы, ногти. Клеточные стенки растений

Защитная

Иммуноглобулины. Ингибиторы трипсина

Антитела (IgM, IgE). Ингибитор трипсина сои, фасоли, пшеницы

Мечение чужих белков для уничтожения. Ингибирование протеаз насекомых

«Ферментативная»

Ферменты

Протеазы. Амилазы

Гидролиз белков. Гидролиз крахмала

Запасная

Ион-связывающие белки. Глиадины

Ферритин. Глиадин пшеницы

«Депо» железа в селезенке. Депо аминокислот в зерне

Транспортная (в организме, через мембраны)

Глобины. Белки ионных каналов

Гемоглобин. Белки ионных каналов

Перенос кислорода в крови. Перенос ионовчерез мембраны

Регуляторная

Гормоны. Факторы регуляции транскрипции

Инсулин. Факторы регуляции транскрипции

Контроль уровня глюко-зы в крови. Регуляции экспрессии генов

Рецепторная

Рецепторы

Рецепторы сиг-нальных молекул фитопатогенов

Активируют/ингибируют защиту растений

Осмотическая

Альбумины

Сывороточный альбумин

Поддержка осмотическо-го давления в крови

Движение (сократительная)

Мышечные

Актин, миозин

Сокращение мышечных волокон






Рисунок 34. Схема синтеза монолигнолов.


Изменение экспрессии генов, кодирующих синтез определенных фенольных продуктов, приводит к изменению уровня содержания различных производных фенолов. Фенолы участвуют в процессах формирования клеточных стенок растений, а также входят в состав различных «красящих» соединений. ГМР сосны с пониженной активность фермента циннамоилалькогольдегидрогеназы (САD) (рис. 34) формируют древесину с более темной окраской. Как видно, для того чтобы покрасить древесину сосны «натурально», т.е. используя природный механизм, «краску» «модифицируют» белком, играющим ключевую роль в синтезе фенольных «красящих» соединений. Этим мы приводим пример того, что белки являются рабочими инструментами клеток живых организмов. ДНК выступает лишь в качестве «сейфа, где хранятся чертежи инструментов, деталей и карта схемы и последовательности сборки конструкций клетки».


^ Лекция 13. Структура и свойства ДНК.


Для понимания принципов конструирования генов необходимы знания структур и свойств ДНК, РНК, белковых молекул, а также процессов транскрипции и трансляции.

Центральной догмой передачи информации в клетке является принцип, или цепочка, ДНК-РНК-белок. Последовательность трех нуклеотидов в молекуле ДНК определяет местоположение одной аминокислоты в полипетидной, или белковой, цепи. Эти три нуклеотида являются генетическим кодом. Соответственно, сколько аминокислот содержится в полипептидной цепи белка, столько троек нуклеотидов содержится в генетическом коде (гене), определяющем синтез этого белка.

Молекула информационной или матричной РНК является своеобразным посредником между геном и молекулой белка (полипептидной цепи). Транспортную РНК можно рассматривать как своеобразного «подносчика патронов» - аминокислот. На одном из участков т-РНК находится антикодон – тройка комплементарных генетическому коду нуклеотидов (рис. 35).

Структура молекулы ДНК расшифрована и изучалась в курсах «Биохимии», «Генетики» и «Молекулярной биологии». Для понимания механизмов конструирования генов и методов анализа ДНК и РНК важно помнить, что существуют две принципиально разные связи в молекуле ДНК: одна из них ковалентная – между остатками фосфорной кислоты и молекулой дезоксирибозы; другая – водородная – между комплементарными нуклеотидами в молекуле ДНК.

Ковалентная связь между нуклеотидами образуется при синтезе ДНК или репликации, когда происходит построение новых цепей ДНК из мономерных нуклеотидов.

Благодаря водородной связи между парами комплементарных нуклеотидов: аденином и тимином, гуанином и цитозином, образующимися за счет незамещенных электронных пар между кислородом и водородом или азотом и водородом две цепочки ДНК соединяются друг с другом. При встрече цепи РНК и одной из цепи ДНК также могут образовываться двойные цепи.

Важно запомнить, что водородная связь между парами оснований в молекуле ДНК может рваться при высокой температуре (выше 90оС). Цепь ДНК при этом распадается на две отдельные нити, которые образованы ковалентными связями между основаниями.

При понижении температуры (ниже 90оС) в определенных условиях две одиночные цепи ДНК могут соединяться за счет возникновения водородных связей между комплементарными основаниями разных нитей ДНК. Образуется двойная цепочка ДНК.

Общая схема передачи генетической информации в клетке представлена на рис. 37.




Рисунок 35. Центральная догма передачи информации в клетке.




Рисунок 36. Схема строения молекулы ДНК.




Рисунок 37. Общая схема генетических процессов в клетке.


Лекция 14. Векторы для переноса генов.


Общая схема получения ГМР показана на рис. 38. Логическая цепь манипуляций с генами включает: выделение целевого гена из организма-донора, встраивание его в вектор (плазмиду), введение вектора в растительную клетку, получение растения-регенеранта, анализ экспрессии гена и проявления фентотипа.

Выделение генов включает выделение ДНК и обработка ее ферментами, расщепляющими ее (рис. 39) в определенных местах (сайтах). Такие ферменты присущи бактериальным организмам, эти белки получили название рестриктазы (рис.40).

Всего выделено не менее сотни рестриктаз, разрезающих ДНК, как «молекулярные ножницы», в строго определенных сайтах (рис. 41). В результате могут образовываться так называемые «липкие» и «тупые» концы ДНК. При наличии комплементарных липких концов независимо от источника выделения ДНК, разрезанные молекулы могут залипать друг на друга. Сшивка цепей по одиночным концевым нуклеотидам за счет образования ковалентных связей происходит с помощью фермента ДНК-лигазы.



Рисунок 38. Общая схема получения трансгенных растений с помощью агробактериальной трансформации.




Рисунок 39. Схематическое разрезание ДНК с помощью рестриктазы.



Рисунок 40. Схема рестрикции ДНК рестриктазой EcoRI.



Рисунок 41. Специфические сайты различных рестриктаз.


В качестве вектора для создания ГМР часто используют плазмиды (рис.42), и, в частности, Ti-плазмиду. Эта плазмида содержит Т-ДНК, которая кодирует синтез низкомолекулярных веществ, индуцирующих образование опухоли у растений. Ti-плазмиды встречаются в агробактериях Agrobacterium tumefaciens. Кроме целевого гена, который коидирует необходимый признак (белок), нужен его промотор, а также два других гена – один из них должен кодировать признак, по которому можно отличить бактерию с вектором (селективный маркер), другой – признак, по которому можно определить, встроился ли вектор в ДНК реципиента (ген «отбора» растения). Оба этих гена также должны нести промоторные участки. Кроме того, вектор должен нести сайт инциации репликации (сайт ori). Таким образом, вектор представляет собой довольно сложную конструкцию (рис. 43). В качестве селективного маркера используют гены, отвечающие за проявление устойчивости бактерий к антибиотикам. Для определения трансформации растительной клетки используют ген, кодирующий синтез флюоресцирующего зеленого белка.




Рисунок 42. Схема создания вектора для переноса генов.



Рисунок 43. Схема строения вектора для переноса генов в растительную клетку.


Лекция 15. Способы трансформации растений.


Существует несколько способов введения векторов в хромосому растительной клетки. Для двудольных растений используют инфицирование клеток бактерией Agrobacterium tumefaciens, содержащей либо один, или два (второй челночный, гибридный) вектора. Инфицирование растений в природе этой бактерией, содержащей указанную плазмиду приводит к образованию опухолей (рис. 45).

Для однодольных растений, а также в других случаях используют метод обстрела (биобаллистика) растительных клеток золотыми или платиновыми частицами, на которых нанесены последовательности ДНК, содержащие целевой, маркерный и др. гены и промоторные области (рис. 46).








Рисунок 44. Образование опухоли у растений вследствие инфицирования Agrobacterium tumefaciens.





Рисунок 45. Схема конструирования векторов и трансформации растений с помощью агробактерии.



Рисунок 46. Схема действия «генной» пушки.


Кроме указанных выше методов, для трансформации используют электропорацию протопластов в растворе, содержащем ДНК. Для этого на протопласты кратковременно воздействуют электрическим током. При этом в плазмалемме образуются поры, через которые в цитоплазму проникает ДНК (рис. 47).





Рисунок 47. Протопласты и свечение зеленого белка в трансформированных протопластах (справа).


К другим методам трансформации относятся микроинъекции ДНК в ядро с помощью тонких стеклянных или из иного материала каппиляров, а также упаковку ДНК в липосомы и слияние их с протопластами.

^ Лекция 16. Анализ результатов модификации ДНК и трансгеноза.


На определенных этапах трансформации необходимо контролировать наличие целевой последовательности ДНК в рестрикционных фрагментах, векторах и т.п. Как уже отмечалось выше, ДНК обладает свойством обратимо распадаться на две одинарные цепочки при высокой температуре (более 90оС). При снижении температуры происходит залипание комплементарных участков друг на друга. Этот процесс может наблюдаться также в том случае, если ДНК обрабатывается щелочным раствором, а затем вновь нейтральным буфером.

Для того, чтобы выявить наличие определенных нуклеотидов в ДНК или в целом организме, вначале синтезируют меченые нуклеотиды. В качестве метки используют флуоресцирующие молекулы или радиоактивные изотоп фосфора (рис. 48).

В первом случае такие молекулы должны быть облучены светом с определенной длиной волны, после чего они начинают испускать свет другой длины волны. Во втором случае, наличие радиоактивности выявляется с помощью фотопленки.

Для выявления определенных участков ДНК проводят электрофорез в агарозном геле или агарозно-полакриламидном геле. Затем разделенные фрагмент ДНК переводят на нитроцеллюлозный фильтр, который прочно связывает молекулы ДНК. Связавшиеся молекулы обрабатывают щелочным раствором, в результате чего одна из нитей ДНК «отрывается» от другой. Затем на фильтр наносят раствор с ДНК-зондом, содержащим метку. Если последовательности ДНК-зонда совпадают с участками анализируемой ДНК, происходит их гибридизация. Сканируя фильтр в определенном свете или засвечивая пленку можно определить наличие зонда и его местоположение.




Рисунок 48. Введение в нуклеотид «цветной» (флуоресцентной, дигоксигенин) или радиоактивной (изотоп Р35) метки (создание ДНК-зонда).





Рисунок 49. Принцип блот-анализа по Саузерену.





Рисунок 50. Схема выявления трансформированного фага в колонии бактерий с помощью ДНК-зонда

В настоящее время для выявления трансформации растений используют зеленый флуоресцирующий белок, или другие конструкции, позволяющие выявить специфические молекулы визуально, непосредственно в растительных тканях (рис.51).






А

Б

Рисунок 51. Растения рапса, трансформированные зеленым флуоресцирующим белком в обычном и ультрафиолетовом свете.


Лекция 17. Принципы создания ГМР, устойчивых к гербицидам.


Устойчивые к гербицидам культурные растения широко возделываются в США, Аргентине, Бразилии, Канаде. Резон их выращивания указан в табл. 9. RR-сорта сои, хлопчатника и других культур, содержат гены, повышающие устойчивость растений к действующему веществу гербицидов - глифосату или глюфосинату. Результаты выращивания таких сортов растений на больших площадях указаны ниже.

Следует отметить, что выращивание таких сортов повышает объем применения гербицидов, таким образом, данная технология возделывания сельскохозяйственных культур является экологически опасной.


Таблица 9. Резон возделывания гм растений (данные фермеров США)



Показатель

Bt-хлопчатник

RR-хлопчатник

RR-соя

Повышение урожайности

55%

76%

65%

Уменьшение стоимости пестицидов

42%

19%

20%

Другие

5%

5%

15%



Результаты возделывания ГУ(RR)-культур (1997-2001 гг, USDA):

- небольшое увеличение объема гербицидов применяемых на 1 гектаре с RR (ROUNDUP READY)-сортами в сравнении с обычными (с 1,27 до 1,36);

- снижение числа активных веществ гербицидов при возделывании RR-сортов в сравнении с обычными (с 3,6 до 1,7 в почвозащитной технологии);

- увеличение объема применения гербицидов при возделывании RR-сортов (в 2-10 раз на 30% площадях, где фермеры обходились низкими дозами сульфонил- и имидазолинон-производных);

- возрастание риска изменения в популяции сорняков и появления устойчивых к гербицидам форм.

Опасность широкомасштабного и длительного применения глифосата:

- изменение видового состава сорняков;

- появление устойчивых форм сорняков;

- изменение в почвенной микрофлоре, увеличение популяции возбудителей корневых гнилей (Fusarium ssp.);

- снижение устойчивости растений к болезням из-за нарушения синтеза ароматических аминокислот, вовлекающихся в укрепление клеточных стенок растений;

- интенсивное возделывание ГУ-сортов истощает почву, что требует восстановления плодородия

Два способа задержки нежелательных последствий:

- ограничение площадей, занятых ГУ сортами (не более 50% площадей ежегодно).

- принцип «множества слабых ударов»(«many little hammers») (много маленьких молотков). Снижение вредоносности за счет множества «слабых» агротехнических защитных приемов.


^ Лекция 18. Принципы создания ГМР, устойчивых к насекомым и болезням.


Целью возделывания растений, устойчивых к насекомым, является снижение пестицидной нагрузки, в частности, уменьшение объема применения инсектицидов. Как видно на рис. 52, к концу 20 века наметилась четкая тенденция снижения объемов использования этих химикатов, в том числе и вследствие внедрения сортов, устойчивых к вредителям (Bt-сортов).

ГМР, устойчивые к вредителям содержат гены бактерии Bacillus thuringiensis, кодирующие синтез белкового токсина. Попадая в кишечник этот белок связывается с эпителиальными клетками и вызывает их разрушение. Интересно, что существуют несколько видов токсинов, по разному действующих на разные виды насекомых. Если в клетках кишечника вредителей имеется рецептор для связывания токсина, то он разрушает кишечник (рис. 53).



Рисунок 52. Объем применения различных инсектицидов в США.






А

Б





В

Г





Д

Е

Рисунок 53. Обработка растений картофеля инсектицидом (А), Bt-кукуруза, устойчивая к кукурузному мотыльку (Б, справа), колорадский жук (В) и хлопковая совка (Г), клетки бактерии B. thuringiensis (Д) и механизм действия вырабатываемого ими токсина (Е).


Конструкция вектора, содержащего Bt-ген, устроена так, что преимущественная его экспрессия происходит в зеленых листьях и стеблях – фотосинтезирующей части растения. Этим определяется низкое содержание токсина в клубнях картофеля (табл. 10). При этом основные показатели качества трансгенного картофеля не отличаются от обычных сортов (табл. 11). Некоторые сорта картофеля содержат гены, кодирующие белки оболочек вирусов, поражающих растения. Таким образом, созданы сельскохозяйственные культуры, устойчивые сразу к двум вредным факторам биогенной природы.


Таблица 10. Содержание трансгенных веществ (мг/кг сырой массы)


Ткань

Сорт

Cry3a (токсин)

Nptii (неомицинфосфо-трансфераза)

Клубня

Shepody

0,08-0,18

0,027

Листа

Nl y shepody

5,96-47,35

0,027


Таблица 11. Основные показатели качества картофеля


Показатель

Shepody*

NewLeaf Y Shepody

Данные литературы

Белок, % сух. массы

6,3

6,4

3,4-7,3

Сахароза, % сыр. массы

0,29

0,31

0,10-0,88

Декстроза, % сыр. массы

0,23

0,21

0,04-0,53

Углеводы, г/100г

84,14

84,41

84,5

Витамин С, мг/100г

23,8

23,9

10,3-22,0

Гликоалкалоиды, мг/100г

4,6

5,3

3,1-16,1


*Shepody – устойчив к жуку, не устойчив к вирусу y

Newleaf y shepody – устойчив к жуку и к вирусу y


^ Лекция 19. ГМР с измененными пищевыми свойствами. Растительные вакцины.


Самым заманчивым для генной инженерии растений является улучшение пищевых свойств получаемой продукции. Дефицит витамина А в пище, связанный с потреблением населением Юго-Восточной Азии риса, может быть преодолен введением генов, меняющих синтез жирных кислот так, что в клетках растений происходит накопление провитамина А. Такой рис получил название «золотого» (рис. 54).

Для текстильной промышленности, использующей химические красители, перспективным является создание хлопчатника с окрашенным волокном.







Рисунок 54. Схема синтеза провитамина А (слева). Генноинженерный продукт «золотой» рис – справа.


Другим примером использования биотехнологии растений не только в сельском хозяйстве, но и медицине является введение в растительные клетки генов, кодирующих синтез белков вирусов, вызывающих инфекции у человека. Одним из интересных направлений является введение в геном растения гена, кодирующего вируса, вызывающего гемморагическую лихорадку. Известно, что переносчиками этой болезни являются мыши. Человек от больного не заражается. Иммунизация мышей возможна путем введения в их организм вирусных компонентов, вызывающих у них иммунитет. Один из реальных путей – создание ГМР, содержащих вирусные белки.

Развиваются работы, связанные с созданием ГМР, содержащих белки вируса, вызывающего СПИД, гепатит B, бактерий, вызывающих холеру

Кроме таких направлений, развиваются исследования, связанные с созданием ГМР, содержащих повышенное или пониженное (кофеин, никотин) количество различных природных веществ, используемых в медицине (например, сердечные гликозиды или растительные стеролы), или в пищу (кофе с низким содержанием кофеина).

Интересным направлением является создание растений, синтезирующих человеческий гемоглобин и коллаген, белки женского молока, гликопротеины, повышающие устойчивость человека к возбудителю язвы желудка бактерии Helicobacter pylori.


^ Лекция 20. ГМР – опасность и перспективы.


ПЕРСПЕКТИВЫ

Промышленность

Быстрорастущие деревья – тополь, эвкалипт, за счет усиления синтеза фитогормонов, синтеза целлюлозы.

^ Модификация окраски древесины (из палевого в красный, фермент (циннамилалкогольдегидрогеназа).

Пища

Повышенное содержание витамина А. «Золотой рис», «золотая кукуруза».

Золотой рис содержит также два гена, контролирующих синтез белка, ответственного за накопление железа и за разрушение фитиновой кислоты, которая в рисе связывает ионы железа и делает их недоступными для организма.

^ Увеличение ненасыщенных жирных кислот (олеиновой кислоты) в семенах масличных культур с 25 до 85%.

Медицина

«Защитники» от сердечнососудистых заболеваний.

Растительные стеролы конкурируют с холестеролом за связывание в кишечнике. Планируется создать растения с высоким содержанием фитостеролов.

^ Растительные вакцины. Иммунизация против гем. лихорадки, гепатита и т.п.

РИСКИ

Токсичность. Bt-белки токсичны. Токсин выявлен в корнях и пыльце, обнаружена токсичность для опылителей (полезной и «нейтральной» энтомофауны) .

^ Перенос генов в близкородственные растения (переопыление с сорняками).

Снижение устойчивости к болезням (соя).

Появление устойчивых форм (насекомые).

^ Перераспределение в популяциях организмов.

Появление новых форм вирусов растений.

Токсичность для человека.

Аллергенность для человека.

Перенос гена устойчивости к антибиотикам к человеку.

Неконтролируемое включение промоторов в геном организмов

^ Неизвестные последствия.


Список использованных источников:


1. Хайруллин Р.М., Уразбахтина Н.А. Биотехнология в растениеводстве. Учебно-методическое пособие к лабораторным занятиям. - Уфа, БГАУ, 2006. - 60 с.

2. Шевелуха В.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. – М.: МСХА, 1998. – 480 с.

3. Шевелуха В.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М.: МСХА, 2003. – 469 с.

4. http://www.fao.org/docrep/006/Y5160E/Y5160E00.htm

5. http://plantsciences.utk.edu/pbg/

6. http://www.monsanto.ru/bio/bio3






оставить комментарий
страница4/4
Дата12.10.2011
Размер0,89 Mb.
ТипУчебно-методический комплекс, Образовательные материалы
Добавить документ в свой блог или на сайт

страницы: 1   2   3   4
средне
  1
отлично
  5
Ваша оценка:
Разместите кнопку на своём сайте или блоге:
rudocs.exdat.com

Загрузка...
База данных защищена авторским правом ©exdat 2000-2017
При копировании материала укажите ссылку
обратиться к администрации
Анализ
Справочники
Сценарии
Рефераты
Курсовые работы
Авторефераты
Программы
Методички
Документы
Понятия

опубликовать
Загрузка...
Документы

наверх