Учебно-методический комплекс по дисциплине «биотехнология растений» Учебно-методический комплекс Составитель: д б. н icon

Учебно-методический комплекс по дисциплине «биотехнология растений» Учебно-методический комплекс Составитель: д б. н


2 чел. помогло.
Смотрите также:
Учебно-методический комплекс по дисциплине «Экология растений» Учебно-методический комплекс...
Учебно-методический комплекс по дисциплине «биотехнология» Учебно-методический комплекс...
Учебно-методический комплекс по дисциплине Cпециальность 050102 Биология Квалификация учитель...
Учебно-методический комплекс по дисциплине «Инновационный менеджмент» Учебно-методический...
Учебно-методический комплекс по дисциплине дс. 02. 1...
Учебно-методический комплекс по дисциплине Теоретические основы прогрессивных технологий (физика...
Учебно-методический комплекс по дисциплине землеведение учебно-методический комплекс...
Учебно-методический комплекс по дисциплине «материаловедение» Учебно-методический комплекс...
Учебно-методический комплекс по дисциплине «материаловедение» Учебно-методический комплекс...
Учебно-методический комплекс по дисциплине «материаловедение» Учебно-методический комплекс...
Учебно-методический комплекс по дисциплине «современные средства оценивания результатов...
Учебно-методический комплекс по дисциплине «история техники» Учебно-методический комплекс...



Загрузка...
страницы: 1   2   3   4
вернуться в начало
скачать

А

Б





В

Г





Д

Е

Рисунок 8. Пересадка микрорастений в ламинар боксе (а-б) и комната для промышленного производства (в). Г - лабораторный газо-вихревой биореактор (слева) и термостатируемая качалка (справа) для культивирования клеток растений и микроорганизмов. Д – схема установки для культивирования корней в среде с углекислым газом. Е - гетеротрофные (а), фотомиксотрофные (в) и фотоаутотрофные (с) корни растения Ipomea aquatica (M.Kino-oka, H.Nagatome, M.Taya, 2001).



К питательным средам предъявляется в первую очередь нативность (целостность) входящих в нее компонентов, способных при некоторых способах стерилизации разрушаться или превращаться в физиологически неактивные соединения.

Питательные среды могут стерилизоваться фильтрацией через специальные фильтры (Зейтца), не пропускающие сквозь мембраны клетки и споры микроорганизмов (фильтры типа «Millipore»).

В растительном материале клетки должны оставаться живыми. Растительный материал стерилизуется различными веществами, убивающими микробов.

Колбы, пробирки и другие сосуды, где будет выращиваться культура, перед заполнением их питательными средами предварительно стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу. Эффективная стерилизация достигается в автоклаве.

Стерилизация растительного материала. Поверхностные покровы растений заселены клетками и спорами микроорганизмов (грибов, бактерий). Стерилизация растительных объектов заключается в уничтожении этих микроорганизмов без повреждения внутренних растительных тканей. Правильный выбор стерилизующего средства заключается в том, чтобы оно незначительно повреждало ткани и, в то же время, губительно действовало на все микроорганизмы.

Для поверхностной стерилизации растительных тканей применяют большой набор химических веществ, которые могут быть разделены на три основные группы.

1. Растворы, содержащие активный хлор: хлорамин, хлорная известь, гипохлорит кальция или натрия. Используют также слабые растворы обычной «Белизны». Токсическое действие этих препаратов наименьшее в сравнении со второй группой веществ.

2. Ртутьсодержащие растворы. Обладают наиболее выраженным дезинфицирующим эффектом и поэтому применяются в тех случаях, когда хлорсодержащие растворы неэффективны. К ним относятся сулема (HgCl2) и диацид (этанолмеркурхлорид с цетилпиридиний хлоридом в качестве детергента).

3. Другие стерилизующие вещества: перекись водорода (Н2О2), раствор йода, марганцовки (KMnO4). Эти вещества часто используются в быту. Действие основано на их высокой способности окислять органические и другие молекулы и, таким образом, обеззараживать поверхностно.


^ Лекция 5. Состав питательных сред для культивирования клеток растений in vitro. Гормональная регуляция мофро- и органогенеза.






Что входит в состав питательных сред для культивирования изолированных клеток, тканей и органов растений?

Вода

Минеральные соли

Источник углерода

Витамины

Регуляторы роста растений

(фитогормоны)

Другие компоненты


Состав и порядок приготовления питательных сред подробно описан в специальной справочной литературе. Компоненты питательных сред выпускаются различными (био)химическими компаниями. Кроме того к ним прилагаются протоколы приготовления. Например:

http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Life_Science/Plant_Biotechnology/ Tissue_Culture_Protocols.html

Основу всех питательных сред при культивировании изолированных растительных органов, тканей и клеток представляет смесь растворимых минеральных солей калия, натрия, кальция, магния в виде нитратов, нитритов, фосфатов, сульфатов (табл.2). Азот, фосфор, сера входят в состав белков, нуклеиновых кислот, других соединений. Ионы К+, Na+, Cl, Н + необходимы для регуляции pH среды и поддержания физиологических градиентов клеток (тургора, осмотического давления, полярности).

Ионы железа, цинка, марганца, молибдена, кобальта входят в состав активных центров ферментов (например, каталазы, пероксидазы, полифенолоксидазы), в сочетании с порфиринами образуют пигменты фотосинтеза (хлорофилла).

Железо используется в виде хелатов [FeО4 или Fe2O4 + ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или соль Na-ЭДТА] – наиболее доступной форме для усвоения растительными тканями.


Таблица 2. Состав питательных сред для культивирования изолированных тканей и клеток растений (Калинин Ф.Л. и др., 1980)

Компоненты среды

Концентрация, мг/л

Мурасиге и Скуга (МС)

Гамборга и Эвелега (В5)

Уайта

Na2SO4





200

Ca(NO3)2





200

NH4NO3

1650

2500



KNO3

1900



80

KCl





65

CaCl2×2H2O

440

150



MgSO4×7H2O

370

250

360

(NH4)2SO4



130



KH2PO4

170



16,5

Na2 ЭДТА

37,3

37,3

37,3

FeSO4×7H2O

27,95

27,95

27,95

NaH2PO4×H2O



150



H3BO3

6,2

3,0

1,5

MnSO4×4H2O

22,3

10,0

4,5

ZnSO4×7H2O

8,6

2,0

1,5

KJ

0,83

0,75

0,75

Fe2(SO4)3





2,5

Na2MoO4×2H2O

0,25

0,25

0,0025

CuSO4×5H2O

0,025

0,025

0,02

CoCl2×6H2O

0,025

0,025



Глицин

2,0



3,0

Мезоинозит

100

100

10

Никотиновая кислота

0,5

1,0

0,5

Пиридоксин–НСl (вит.В6)

0,5

1,0

0,1

Тиамин – НСl (вит. В1)

1,0

10,0

0,1

Сахароза

30000

3000

20000


Так как питание культивируемых in vitro тканей является гетеротрофным, как источники углерода в состав среды вводятся сахароза или глюкоза, в концентрации 20-60 г/л. Для стимуляции жизнедеятельности клеток используют витамины: группы В (В1 – тиамин, В6 – пиридоксин), С (аскорбиновую кислоту), РР (никотиновую кислоту), мезоинозит. Витамины группы В используют в виде солянокислых солей.

Для регуляции процессов деления и роста растительных клеток, органогенеза и другими в культуре тканей необходимы фитогормоны (табл.3, рис.9). Чаще всего используют гормоны, стимулирующие рост и развитие растений: ауксины, цитокинины, гиббереллины.

К ауксинам относятся: -индолил-3-уксусная кислота (ИУК), природное соединение, а также синтетические – индолил-3-масляная кислота (ИМК), -нафтилуксусная кислота (НУК), 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д). ИУК влияет на образование корней (ризогенез) и их дальнейший рост, применяют в концентрации 1-2 мг/л. Активный стимулятор корнеобразования ИМК используют в концентрации – 0,1-1мг/л, α-НУК – 0,5-1мг/л (стимулятор каллусообразования). 2,4-Д стимулирует процесс дедифференцировки, это объясняется активацией протонной помпы и связанного с ней «истончения» клеточной стенки за счет индукции синтеза ряда ферментов, вызывающих частичный гидролиз клеточной стенки, а также индукцией репликации ДНК. Этот ауксин стимулирует деление клеток и синтез нуклеиновых кислот.

Цитокинины представлены: кинетином (6-фурфуриламинопурин), зеатином, зеатин-рибозидом, N-дифенил-мочевиной, 6-бензиламинопурином (6-БАП). Они стимулируют клеточное деление, способствуют дифференциации почек, ингибируют корнеобразование. Применяют в концентрации 0,02-0,5 мг/л.

К гиббереллинам относятся различные формы гибберелловой кислоты (ГК), обычно ГК3. Для ГК характерно действие на клеточное деление в меристематических зонах, а не в дифференцированной ткани. Обычно в питательных средах применяют концентрацию 0,2 мг/л.


Таблица 3. Основные классы фитогормонов и их функции


Фитогормон

Представитель

Функция в культуре тканей

Ауксины

Индолил-3-уксусная кислота (ИУК)

Индолил-3-масляная кислота (ИМК)

Калиевая соль ИМК

-нафтилуксусная кислота (НУК)

2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д)

p-хлорофеноксиуксусная кислота

Пиклорам

Дикамба

Формирование адвентивных корней

(высокая концентрация)

Формирование адвентивных побегов

(низкая концентрация)

Индукция соматического эмбриогенеза

Деление клеток

Формирование каллусной ткани и ее рост

Ингибирование пазушных почек

Ингибирование удлинения корней

Цитокинины

6-бензиламинопурин

6-,-диметилаллиламинопурин (2iP)

Кинетин

Тидиазурон (TDZ)

N-(2-хлоро-4-пиридил)-N’фенилмочевина

Формирование адвентивных побегов

Ингибирование формирования корней

Индукция соматического эмбриогенеза

Стимуляция деления клеток

Индукция каллусообразования и роста

Стимуляция роста пазушных почек

Ингибирование роста побегов

Гибберел-лины

Гибберелловая кислота

Формирование удлинения побегов

Пробуждение пазушных почек, семян, зародышей

Ингибирование роста адвентивных корней

Абсцизовая кислота

Абсцизовая кислота

Стимуляция образования клубней и корнеплодов

Стимуляция формирования зародышей

Инициация покоя

Полиамины

Путресцин

Спермидин

Индуцирует формирование адвентивных корней

Индуцирует соматический эмбриогенез

Индуцирует формирования побегов



Рисунок 9. Действие разных регуляторов роста на развитие микрорастений сливы.


В качестве биологических добавок для индукции различных процессов используют аминокислоты (глицин), кокосовое молоко (жидкий эндосперм кокосового ореха), вытяжки из незрелых зерновок кукурузы и т.д.

Для сред по прописи МС, например, готовят отдельно маточные растворы компонентов, увеличивая их концентрацию по сравнению с прописью: соли макроэлементов (без солей кальция и хелата железа) – в 10 или 20 раз; соли микроэлементов – в 400 или 100 раз, соли кальция и хелаты железа – в 10 раз.

Растворы фитогормонов желательно готовить непосредственно перед работой со средами. При приготовлении кинетина важно использовать не более 2-3 капель 1N КОН (возможно сильное подщелачивание среды). ИУК растворяют в этаноле или его 70-80%-ных водных растворах.

Маточные (концентрированные) растворы хранят в специальных условиях: соли – в сосудах с притертыми пробками при 0…+4оС; витамины, фитогормоны, ферменты, растительные экстракты – при –20оС в небольших, по 5-10 мл, сосудах с пробками.

При работе in vitro применяют жидкие и твердые среды. Жидкие среды используются для культивирования клеток и протопластов (суспензионная культура). При этом для поддержания эксплантов каллусов, изолированных органов и тканей в пробирки со средой помещают специальные мостики-поддержки из фильтровальной бумаги или пористых синтетических материалов.

Агаризованные среды готовят на основе агара (агар-агара) – полисахарида, входящего в состав морских водорослей, который образует в воде однородный коллоидный раствор с pH 5,6-6,0 при температуре выше 40оС, а ниже этой – застывает в виде геля (рис. 10). Иногда в качестве уплотнителя и заменителя агар-агара используют полиакриламидные гели (биогели) P10 и P200.




Рисунок 10. Структура агара (полисахарида, состоящего из D-галактозы и 3,6-ангидро-L-галактозы, соединенных β1→4 и α1→3 связями).

Следует особо подчеркнуть – агар не рассматривается как питательный субстрат, а, в первую очередь, как поддерживающая гелеобразующая среда.


^ Лекция 6. Дедифференциация и морфогенез растительных клеток in vitro: технология управления.


Различное использование культуры тканей растений для получения целевых продуктов:

- каллусные суспензионные (клеточные) культуры;

- соматический эмбриогенез;

- культура гаплоидов;

- культура протопластов и соматическая гибридизация;

- микроклональное размножение;

- органогенез;

- получение безвирусного посадочного материала;

- сомаклональная изменчивость;

- селекция клеток, устойчивых к неблагоприятным факторам среды;

- мутагенез in vitro;

- криосохранение.


Каждая растительная клетка делится, растет, дифференцируется, утолщается вторичная клеточная оболочка, в результате клетка теряет способность к делению. Экспланты представляют собой ткани с прошедшими деление, сформировавшимися специализированными клетками (кроме меристематических). Чтобы вновь возвратить клетки в меристематическое состояние (дедифференцировка) в питательную среду добавляют индукторы клеточного деления – фитогормоны: ауксины и цитокинины. Без них не образуется каллусная ткань.

Каллус (от латинского callus – мозоль) – это неорганизованно растущая (пролиферирующая) ткань, состоящая из дедифференцированных клеток. Каллусы могут быть получены из изолированных органов растений – эксплантов (корней, побегов, листьев) или из определенных типов клеток (пыльца, эндосперм).

Получение каллусной ткани требует дедифференцировку клеток. Дедифференциация возможна в присутствии фитогормонов двух классов: ауксинов, например, индолилуксусной кислоты, 2,4-Д, и цитокининов (зеатин-рибозид, кинетин и др.)

Каллусная клетка повторяет онтогенез любой клетки и включает деление, растяжение и дифференцировку, старение и отмирание клетки. Ростовая кривая клеток S-образной формы (рис. 11), включает 6 фаз:

– латентная (1) – клетки подготавливаются к делению,

– экспоненциальная (2) – наблюдается наибольшая митотическая активность и увеличивается масса каллусной культуры,

– линейная (3) – характеризуется постоянной скоростью роста,

– замедленного роста (4) – митотическая активность резко снижается,

– стационарная (5) – начинается деградация клеток, но еще она уравновешивается возрастанием числа клеток за счет их деления,

– отмирания (6) – число и масса живых клеток уменьшаются.



Р
Время
исунок 11. Ростовая кривая каллусных клеток


Для получения каллуса стерильные эксплантаты переносят на агаризованную среду (для каждого вида растений и органа или ткани подбирается наилучший состав среды, как, например, для каллусов из стеблей картофеля, табл. 4) и слегка вдавливают их в агар для обеспечения хорошего контакта со средой.

Чашки Петри (пробирки, колбы) запечатывают, чтобы предотвратить высыхание и инкубируют в темноте при 25оС и 70%-ной относительной влажности воздуха.

При оптимально подобранной среде большая часть эксплантов за 3-8 недель образует каллусы в количестве, достаточном для пересадки. В процессе пересадки (пассирование) стерильным пинцетом каллусы переносят в стерильную чашку Петри. После асептического отделения старых некротизированных участков и кусочков приставшей агаризованной среды каллус делят на равные кусочки, переносят их в колбы или пробирки со свежей питательной средой.


Таблица 4. Модифицированная питательная среда для индукции каллуса из стебля картофеля (Шевелуха В.С., 1996)

Компоненты питательной среды

Концентрация, мг/л

Минеральные элементы

по прописи МС

Сахароза

20000

Гидролизат казеина

1000

Мезоинозит

100

Тиамин

0,5

Пиридоксин

0,5

Аденин

1,0

Глицин

1,0

Никотиновая кислота

5,0

Фолиевая кислота

0,5

Зеатин

0,05




Кинетин

0,2




2,4-Д

3,0




Агар-агар

7000




Значение рН среды

5,8





Пассировать каллус можно неограниченное число раз. При длительных пассажах каллусы приобретают способность расти без гормонов, т.е. становятся автономными по отношению к ним. Такие клетки называют «привыкшими». Нередко ткани, образованные «привыкшими» клетками, называют химическими опухолями.

Общим свойством «привыкших» и опухолевых растительных тканей является их гормононезависимость, т.е. способность расти в средах без гормонов, т.к. идет интенсивный синтез собственных. Это их основное отличие от каллусных тканей, для которых присутствие гормонов в питательной среде является необходимым условием дедифференцировки и пролиферации клеток.

У «привыкших» тканей гормононезависимость достигается в результате изменения активности генов, отвечающих за синтез ферментов, участвующих в построении гормонов, отвечающих за их синтез.

В опухолевых тканях растений синтез гормонов связан с переносом в растительную клетку бактериального гена, например при инфицировании бактерией Agrobacterium tumefaciens, отвечающего за этот процесс (т.е. в результате переноса чужого гена из бактериальной клетки в растительную).

Каллусные клетки генетически неоднородны – отличаются по числу хромосом (различная плоидность), и эта особенность позволяет использовать их для клеточной селекции на устойчивость к неблагоприятным факторам среды, фитопатогенам и на повышенную продуктивность.




Рисунок 12. Виды морфогенеза и влияющие на него факторы


Использование каллусных культур.

1. Для размножения растений через соматический эмбриогенез или органогенез (рис.12-13).

2. Получение гаплоидных культур.

Культура гаплоидов позволяет получить из пыльцевых или яйцеклеток гаплоидные растения (содержащие набор хромосом n). Удвоение хромосом в культуре гаплоидов позволяет получить гомозиготные диплоиды, что ускоряет процесс селекции и важно при изучении отдельных признаков у растений.

Гаплоиды ценны для получения гомозиготных линий, у которых признаки проявляются сразу, т.е. для выявления рецессивных мутаций. Различают три способа получения гаплоидных растений: андрогенез – получение растений из клеток пыльцы; гиногенез – получение гаплоидных растений из изолированных семяпочек; партеногенез – получение растений из гибридного зародыша, у которого потеряны отцовские хромосомы. Для получения диплоидов используют искусственное удвоение хромосом (например, с помощью колхицина). Этим методом получены сорта ячменя Одесский-15, Исток.

Одним из распространенных способов получения отдаленных гибридов является оплодотворение in vitro. Этим методом преодолевается прогамная несовместимость, например, культивируется завязь с нанесенной пыльцой или пыльца на плаценте семяпочки (завязь вскрывается) или рядом с плацентой. Таким способом получен отдаленный гибрид N.tabacum+N.rosulata. Метод используется также для преодоления постгамной несовместимости, когда после оплодотворения in vivo зародыши культивируются in vitro (эмбриокультура).


А



Б



В




Рисунок 13. Сравнение зиготического (через оплодотворение) и соматического (in vitro из каллусной ткани) эмбриогенеза. А – слева – срез через зародыш зерновки ежи сборной Dactylis glomerata: ЭН – эндосперм, СК – скутелла, КЛ – колеоптиль, МП – меристема побега, ЩТ – ткань щитка, МК – меристема корня, КЛР – колеориза, А - справа срез через каллусную ткань (КЛТ). Б – развивающийся зародыш растения. В – побеги, формирующиеся из каллусной ткани.


^ 3. Получение новых сортов (линий) путем сомаклональной изменчивости.

Сомаклональные вариации (сомаклональная изменчивость) – фенотипическое выражение непостоянства геномов ядра и органелл растительных клеток. Проявляется в том, что растения, регенерировавшие из клеток (тканей) несут какие-либо отклонения от исходной формы растения.

4. Для экспериментального мутагенеза in vitro.

5. Для генетической инженерии.

Лекция 7. Микроклональное размножение растений. Получение безвирусного посадочного материала растений.


Микроклональное размножение растений (рис. 14) – аналогично вегетативному типу размножения, разница лишь в том, что оно протекает в пробирках на искусственных питательных средах (in vitro), где из изолированных тканей в итоге можно получить достаточно большое количество новых растений.

Преимущества клонального микроразмножения перед обычным:

– высокий коэффициент размножения (106-для травянистых, 105-для кустарниковых, 104 – для хвойных);

– освобождение от вирусов и другой инфекции;

– возможность круглогодичного размножения;

– размножение трудноразмножаемых растений;

– экономия площадей;

– отличная транспортабельность на дальние расстояния;

– длительное хранение (криосохранение).

Этапы клонального микроразмножения растений:

а) введение в культуру in vitro, стимулирование эксплантата к дальнейшему развитию;

б) собственно размножение микроклонов;

в) ризогенез вновь образованных in vitro побегов;

г) акклиматизация микроклонов к нестерильным условиям.

Способы клонального микроразмножения.

1. Активация развития уже существующих в растении меристем.

2. Индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта.

3. Дифференциация из соматических клеток зародышеподобных структур.

4. Дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани.

Факторы, влияющие на клональное микроразмножение:

- генетические (род и вид растения, сорт)

- физиологические (возраст экспланта, время отбора, размер, месторасположение и др.);

- гормональные;

- средовые;

- физические.

^ 1. Активация развития уже существующих в растении меристем. Основывается на снятии апикального доминирования. Это достигается удалением верхушечной меристемы стебля и последующим микрочеренкованием побегов in vitro на безгормональной среде или добавлением в питательную среду веществ цитокининовой природы, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов. Полученные побеги отделяют от первичного материнского экспланта и вновь самостоятельно культивируют на свежеприготовленной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков. Этот метод широко используется для размножения культур промышленного цветоводства, плодово-ягодных культур, древесных растений.

^ 2. Индукция адвентивных почек непосредственно тканями экспланта. Она основана на способности восстановления недостающих органов у изолированных частей растения, а при благоприятных условиях – регенерации целых растений. Из любых органов и тканей растения можно добиться образования адвентивных почек (лист, стебель, сегменты корней), если их удается получить свободными от инфекции. Этот процесс происходит на питательной среде, содержащей только цитокинины или эти фитогормоны в сочетании с ауксинами (10:1, 100:1).

^ 3. Дифференциация из соматических клеток зародышеподобных структур. Этот метод получил название – соматический эмбриогенез. Основное отличие образования зародышей in vitro от in vivo (в естественных условиях) заключается в том, что соматические зародыши развиваются асексуально вне зародышевого мешка и по виду напоминают биполярные структуры, у которых одновременно наблюдаются развитие апикальных меристем стебля и корня.

Соматический эмбриогенез можно непосредственно наблюдать в тканях первичного экспланта, а также в каллусной культуре. Но посадочный материал, полученный таким методом, будет генетически нестабилен по отношению к растению донору.

^ 4. Дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани. Мало используется в целях получения посадочного материала in vitro. При периодическом пересаживании каллусной ткани на свежую питательную среду, изменяется плоидность культивируемых клеток, появляются структурные перестройки в хромосомах и возникают генные мутации, теряется морфогенетический потенциал культивируемых клеток. Эти изменения при длительном культивировании каллусных клеток накапливаются. Поэтому при клональном микроразмножении период неорганизованного роста должен быть сведен к минимуму.

До 30 и более процентов потерь урожая сельскохозяйственных культур могут вызвать вирусы. Одним из растений, особенно страдающими от поражения вирусными заболеваниями, является картофель. Картофель подвержен поражению многими вирусами (X, Y, S, F, M, A, L и др.). Эти вирусы вызывают такие болезни картофеля, как мозаика листа, скручивание листьев картофеля, морщинистая мозаика, желтая карликовость и др. От больного растения к здоровому вирусы передаются двумя путями: контактным и насекомыми через их ротовой аппарат, содержащий микрокапли сока и, соответственно, вирусные частицы. Почти все вирусы, попав в организм растения, некоторое время могут находиться в скрытом состоянии, не вызывая внешних симптомов. Инфекция снижает урожайность культуры, содержание крахмала в клубнях, влияет на другие качественные показатели. Пораженные растения сами становятся источником инфекции.





1

2





3

4





5

6






Рисунок 14. Этапы микроклонального размножения роз. 1 – растения розы; 2-3 черенкование; 4 - высадка стерильных эксплантов в среду; 5 - ризогенез микрорастений; 6- высадка микрорастений в горшочки; 7 -микрорастения другого вида в кассетах; 8 – поддержание высокой влажности для укоренения и выживания микрорастений в теплице.




Рисунок 15. Схема получения безвирусного семенного материала картофеля.


Оздоровление картофеля от вирусных болезней повышает эффективность органических и минеральных удобрений, вносимых под картофель, обеспечивает длительное сохранение продуктивности сортов, увеличивает урожай картофеля не менее чем на 25-30%. Многие из вирусов распространяются по флоэмным элементам, и на этом свойстве основано оздоровление растений in vitro. Апикальные меристемы побегов свободны от вирусов, в ней нет дифференцированных флоэмных элементов. Поэтому верхушки растений содержат меньшее количество вирусов по сравнению с другими частями. Апикальная меристема представляет собой конус активно делящихся клеток, и она почти свободна от вирусной инфекции. Концентрацию вирусов можно снизить также, выдерживая растения при повышенной температуре (термотерапия), или обрабатывая их веществами, ингибирующими развитие вирусов (хемотерапия). В сочетании с термо- и хемотерапией (обработка растений метод верхушечной меристемы является наиболее эффективным способом оздоровления растений. Современное семеноводство картофеля основано на биотехнологическом методе апикальной меристемы освобождения от вирусных и других болезней (рис. 15). Схема производства безвирусных клубней включает получение микрорастений (клонов) картофеля, затем высадку их в теплицы или под укрытия для избежания контакта с насекомыми, в результате чего получают супер-супер элиту (обычно в виде микроклубней). При высадке микроклубней получают суперэлитный материал в виде клубней обычных размеров.

Лекция 8. Использование культуры клеток в селекции растений.


1. Культура протопластов и соматическая гибридизация (рис. 16).

2. Селекция клеток, устойчивых к неблагоприятным факторам среды (рис. 17-19).

Протопласт – клетка без клеточной стенки (рис. 16). Протопласты получают путем удаления клеточной стеник растений ферментами (пектиназой и целлюлазой). При определенных условиях протопласты могут сливаться, объединяя, таким образом, два генома в одном. Если у одной из клеток удалить ядро, то могут получиться гибриды, содержащие ядро одного вида растения и цитоплазму и органеллы (кроме ядра) другого вида растения. Такая система позволяет получить отдаленные гибриды (межвидовые и межродовые).


А

Б















В

Г

Рисунок 16. Протопласты (А-Б), слияние (В) и соматический гибрид (Г).



Рисунок 17. Пути и направления селекции клеток растений in vitro, устойчивых к неблагоприятным факторам среды.




Рисунок 18. Использование двойной культуры иммунной пшеницы Triticum timopheevii и гриба Tilletia caries для изучения взаимоотношений растении-хозяин – патоген.





Рисунок 19. Двойная культура иммунной пшеницы T. timopheevii и гриба T. caries. Белый налет сверху – мицелий гриба, которые не формирует споры в природе в тканях иммунной пшеницы T. timopheevii.


^ Лекция 9. Биотехнология растений в производстве лекарственных и косметических препаратов.

Биотехнология растений, отдельные методы и приемы которой описаны выше используется, как правило, для нужд растениеводства. Однако, выращивание культуры клеток имеет и «собственно» биотехнологическое значение, когда промышленные продукты получаются непосредственно из культуры клеток, а затем очищаются и концентрируются. Такими продуктами являются лекарственные препараты, когда их продуцентами являются, например, редкие, долго растущие или охраняемые виды растений, или растения – эндемики (рис. 20).

Для производства лекарственных или косметических препаратов могут использоваться каллусные культуры, а также суспензионные культуры клеток. Последние получают, выращивая клетки в биореакторах, аналогично клеткам микробов или грибов. Особенности культивирования растительных клеток указаны на рис. 21-22.

Использование культуры растительных клеток вместо химического синтеза природных аналогов препаратов обосновывается наличием в продуктах химического синтеза побочных примесей, попутно получаемых при этом, которые могут быть вредными для человека. Кроме того, лечебный или другой эффект растительных препаратов может определяться суммой воздействующих на организм соединений.

В последнее время исследователями ведется поиск растительных соединений, заменяющих полимерные материалы и другие продукты – производные нефтепродуктов, которые можно получать в промышленных масштабах. Отдельным направлением является технология получения биотоплива, однако, она использует натуральное растительное сырье.

К одному из отраслевых подразделений биотехнологии (растений) можно отнести инженерную энзимологию, которая использует свойства ферментов для производства промышленных продуктов. Интересным и многообещающим направлением в инженерной энзимологии является использование ферментов для получения энергии. Этот способ является безопасным (например, химическое превращение глюкозы), ресурсы его воспроизводимы, а коэффициент полезного действия очень высок. Кроме того, температурный интервал работы биоэнергетических установок довольно широк.

Еще одним из направлений использования растительных клеток является использование их как продуцентов веществ, например, вирусных белков, которые способны иммунизировать человека или животных. Однако, на наш взгляд, такие работы «удобнее» рассматривать в направлении биотехнологии растений, которая называется генетическая инженерия растений.





Рисунок 20. Биотехнологические продукты растительных клеток и особенности их получения.




Рисунок 21. Особенности свойств растительных клеток, которые необходимо учитывать при культивировании в биореакторах.



Рисунок 22. Схема использования иммобилизованных клеток для получения продукта.


Лекция 10. Н.И.Вавилов – основоположник глобальной системы сбора, сохранения, изучения, систематизации и паспортизации генетических ресурсов растений (по материалам проф. Конарева А.В.).


Н.И.Вавилов – один из пионеров создания на базе Всероссийского института растениеводства (г. Санкт-Петербург) глобальной системы сбора, сохранения, изучения, систематизации и паспортизации генетических ресурсов растений (ГРР).

Следуя концепции Н.И.Вавилова об исходном материале, сотрудники ВИР изучают коллекции генетических ресурсов для выделения источников и доноров селекционно-ценных признаков и передают их в селекционные центры страны (табл.4-5, рис. 22).

Как результат такой кооперации более 70% всех районированных российских сортов (зерновых культур – до 95%) были созданы с участием мировой коллекции ВИР. Используя образцы мировой коллекции ВИР, селекционеры страны создали более 2500 сортов различных сельскохозяйственных культур.

Многие годы считалось, что основной задачей земледелия является увеличение производства с.-х. продукции. Принципиально ситуация стала изменяться лишь в последние десятилетия 20 века, когда развитые страны начали испытывать избыток продуктов питания, и фактор качества стал одним из решающих в конкуренции с.-х. продукции.

Таблица 4. Страны – держатели крупных коллекций генетических ресурсов растений. Общее число образцов > 3,2 млн.





Таблица 5. Мировая коллекция ВИР им. Н.И.Вавилова (2005 г.)





Девиз конгресса ЕУКАРПИЯ в 1989 году: «Накормим население Земли высококачественными и натуральными (экологически и биологически безвредными) продуктами растениеводства». Понятие «качество с.-х. продукции» включает питательные, кормовые и технологические достоинства соответствующей продукции растениеводства.

Общепризнано, что источники новых генов, отвечающих за необходимые признаки у сельскохозяйственных культур, разнообразны в центрах происхождения растений.

С 1960-х годов под руководством В.Г. Конарева (работавшего в г Уфе и организовавшего лабораторию нуклеиновых кислот, переросшую затем в Отдел биохимии и цитохимии Башкирского филиала АН СССР, а ныне - Институт биохимии и генетики УНЦ РАН) закладывались и развивались молекулярно-биологические исследования, которые всегда были ориентированы на решение важнейших теоретических и прикладных проблем сбора, изучения, сохранения и поддержания, а также идентификации и паспортизации генетических ресурсов растений (1967-2006 гг.).




Рисунок 22. Центры происхождения культурных растений.


Молекулярное маркирование - эффективный методический подход к познанию и управлению генетическими ресурсами растений (ГРР)

Понятие «маркер» вошло в биологию давно (маркер – метчик, в биохимии – фактор идентификации). Сейчас это понятие используется широко. Это может быть ген (или его аллель), наcледование которого прослеживается в скрещивании. Он может определять конкретный фенотипический признак, либо быть сопряженным с его изменчивостью (А.В. Конарев). На практике экспериментатор, как правило, имеет дело не с самим геном-маркером, а с его фенотипическим выражением – хорошо проявляющимся, дискретным, т. е. качественным признаком. Последний можно рассматривать как фактор идентификации соответствующего ему гена, т.е. как маркер гена, а также сцепленных с ним других генов.

Генетические маркеры идентифицируют признаки индивидуального генотипа и/или фенотипа. Их наследование может быть прослежено в поколениях. В качестве генетических маркеров могут служить морфологические признаки, ДНК- и белковые маркеры (молекулярные маркеры - ММ).

Надежным маркером является белковый признак, поскольку белок – первичный продукт гена и первый этап реализации биологической информации. Именно через белки генетическая информация реализуется во всех метаболических и морфогенетических процессах. По этой и ряду других причин именно белкам как генетическим маркерам в ВИРе было отдано предпочтение особенно в решении прикладных задач ГРР и растениеводства (идентификация ГРР, сортоиспытание, семеноводство, семенной контроль). Белковые маркеры позволяют оценивать аллельную, генную и геномную специфичность, проводить анализ различных генетических систем (В.Г.Конарев, 1974-2005).

В ВИРе В. Г. Конарев, И. П. Гаврилюк, Н. К. Губарева, Т.И. Пенева и др. разработали и внедрили унифицированную систему идентификации и паспортизации мировых ГРР на основе электрофоретических спектров запасных белков (1972-2005 гг.). В основу системы положен принцип эталонного спектра культуры, который формируется по результатам фундаментального изучения внутривидовой изменчивости соответствующего маркерного белка в мировой коллекции (анализ десятков тысяч генотипов), а также генетической и биохимической природы маркерного белка.

Для этого используют разделение белков в электрическом поле в пористой среде, называемой гелем. В качестве геля используют полимеризующийся раствор акриламида, в результате чего получают полиакриламидный гель (ПААГ). Для того, чтобы белки разделялись строг пор размеру, а не по заряду, их специальным образом обрабатывают различными реагентами, основной из которых додецилсульфат натрия, который «обволакивает» денатурированную кипячением цепочку белка и придает ей отрицательный заряд (рис. 23-24).

Гель формируют так, чтобы с электродами соприкасались только его верхняя и нижняя части. В верхней части геля формируют с помощью «гребенки» лунки, куда вносят образцы белков. После окончания электрофоретического разделения, о котором судят по приближению окрашенного вещества к нижней части геля, гель вынимают из камеры и красят специальным красителем, который выявляет только белки. Сам гель остается прозрачным. Расположение определенной группы (запасных) белков зависит от их размеров, что определяется, в свою очередь их структурой, которая зависит от генов, отвечающих за их синтез.




Рисунок 23. Схема прибора для электрофореза белков и их разделения в (ПААГ).




Рисунок 24. Схема ДСН (SDS)-электрофореза белков в ПААГ





Рисунок 25. Страница электронного каталога коллекции ВИР основанного на белковых формулах


Принцип идентификации генотипов (биотипов) по спектрам запасных белков (рис. 25) в течение многих лет и на многих культурах используется:

- для идентификации и паспортизации генетического разнообразия растений (образцов коллекции);

- для поиска нового генетического разнообразия (образцов) и привлечения его в мировые коллекции;

- в анализе генетической структуры коллекций (выяснение степени генетической дифференциации генофондов видов);

- для выявления дублетных образцов в мировых коллекциях;

- для выяснения степени генетической целостности сохраняемых и периодически пересеваемых образцов коллекции;

- для охраны авторских прав ВИР при использовании образцов в качестве источников или доноров при селекции и т.д.

С 2000 г. в РФ: «…элитные семена всех сортов пшеницы и ячменя, предназначенные для реализации, подлежат определению их сортовой принадлежности стандартным методом электрофореза в аккредитованных (испытательных) лабораториях».

Крупнейшие пивоваренные, солодовенные компании России, а также торгующие зерном ячменя все активнее подключаются к тестированию партий зерна электрофорезом в аккредитованных Испытательных лабораториях.

Анализ в последний год более 70 товарных партий зерна пивоваренного ячменя (сорта Гонар, Скарлетт, Анабель и др.) показал, что в ряде случаев предполагаемые для закупки партии зерна по своим характеристикам полностью не соответствовали заявленному сорту. Примеси других сортов, в т.ч. неидентифицируемых иногда составляли от 50 до 95%.

Типичной для большинства партий этих сортов было изменение свойственного для сорта соотношения зерен, имеющих разные типы спектра (например для Скарлетта – типы I:II - 60:40%). При соотношении I:II – 95:5%, примесь др. сортов составляла 2-4%. Есть основания считать, что это есть результат нормальной реакции сорта (зарубежного) на нетипичную для него среду.

В настоящее время в нашей стране наибольшая потребность в стандартных методах электрофореза проявляется в оценке сортовой чистоты и подлинности партий семян пивоваренных сортов ячменя, пшеницы, гибридов кукурузы, сортов и гибридов подсолнечника, свеклы, капусты, лука, а также др. овощных культур.

«Электрофоретический сертификат» качества необходим, в частности, для партий семян предлагаемых за рубеж.

Выход нашей страны на международный рынок семян, а также перспективы ее вступления в ВТО обязывают наших производителей семян и контролирующие органы ориентироваться на соответствующие международные стандарты оценки качества семян, а отечественных разработчиков методов семенного контроля не только более активно пропагандировать и внедрять современные методы контроля, но и ответственно относиться к оценке их надежности и экономической целесообразности внедрения.


^ Лекция 11. Генетическая инженерия – новейшая биотехнология растений.


Ген – участок молекулы ДНК, кодирующий структуру белка, РНК или определенную регуляторную функцию.

Генная инженерия – совокупность приемов, методов, технологий, в том числе по получению рекомбинантных РНК и ДНК, по выделению генов из организма, манипуляциям с ними и введению их в другие организмы.

Геном – совокупность генов, содержащихся в гаплоидном (одинарном) наборе хромосом и в нехромосомных генах, расположенных в органеллах протоплазмы данного организма. Диплоидные организмы содержат два генома – отцовский и материнский.

Для усвоения следующего курса лекционного материала необходимо знать основные термины, используемые в молекулярной биологии и генетики.

1. Блот-гибридизация (блотинг) ДНК (РНК) – перенос ДНК (РНК) из геля, в котором проводился электрофорез этих молекул, на фильтр (нитроцеллюлозный) для гибридизации с комплементарными нуклеотидными последовательностями.

Саузерн-блот гибридизация – идентификация участков молекул ДНК, разделенных электрофорезом в геле и фиксированных на твердом матриксе (нитроцеллюлозный фильтр) с помощью комплементарного участка ДНК-зонда (меченой молекулы ДНК).

Нозерн-блот гибридизация – идентификация участков молекул РНК разделенных электрофорезом в геле и фиксированных на твердом матриксе (нитроцеллюлозный фильтр) с помощью комплементарного участка ДНК-зонда.

2. Библиотека генома – набор клонированных фрагментов ДНК, содержащий весь геном.

3. Бактериофаги (фаги) – вирусы, инфицирующие бактерии.

4. Вектор – самореплицирующаяся (автономная) молекула ДНК, используемая в генной инженерии для переноса генов от организма-донора в организм-реципиент, а также для клонирования нуклеотидных последовательностей.

5. Генная инженерия – совокупность приемов, методов, технологий, в том числе по получению рекомбинантных РНК и ДНК, по выделению генов из организма, манипуляциям с ними и введению их в другие организмы.

6. ДНК-маркер – фрагмент ДНК известного размера, используемый для калибровки других фрагментов в геле при их электрофорезе.

7. Инокулюм (трансплант) – часть суспензионной (каллусной) культуры, используемая для пересадки в свежую среду.

8. Клонирование – получение генетически идентичных клеток, организмов, популяций, а также молекул ДНК.

9. Нуклеотид – фосфорный эфир нуклеозида, состоит из азотистого основания (пуринового или пиримидинового), углевода рибозы или дезоксирибозы и одного или нескольких остатков фосфорной кислоты. Входит в состав нуклеиновых кислот, коферментов, биологически активных соединений.

10. Плазмида – кольцевая двухцепочечная внехромосомная молекула ДНК, способная к автономной репликации, а также к встраиванию в другую молекулу ДНК и передачи в геном реципиента чужеродных генов и других последовательностей ДНК.

11. Полимераза – фермент, связывающий между собой большое число исходных или идентичных субъединиц в большую единицу или полимер, например ДНК-полимераза или РНК-полимераза.

12. Репликация (редупликация) ДНК – самоудвоение молекулы ДНК путем образования ее копий при помощи набора ферментов.

13. Рекомбинантный(ая) ген (ДНК) – ген (ДНК), состоящий (ая)из компонентов различных генов (ДНК).

14. Рестриктаза – фермент разрывающий (разрезающий) молекулу ДНК в специфическом месте (сайте).

15. Секвенирование ДНК – определение последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК.

16. Трансгеноз – процесс переноса с помощью различных векторов донорских, чужеродных генов в клетки-рецепиенты.

17. Трансген – ген, перенесенный в геном клеток и организмов в результате трансгеноза.

18. Трансформация – перенос генетического материала от одного организма к другому.

19. Экспрессия гена – проявление функционирования генетической информации, в виде молекул РНК, белка или фенотипического признака.

20. Трансформация – перенос генетического материала от одного организма к другому.

21. Трансгеноз – процесс переноса с помощью различных векторов донорских, чужеродных генов в клетки-рецепиенты.

22. Трансген – ген, перенесенный в геном клеток и организмов в результате трансгеноза.

Трансгенные растения широко используются в сельском хозяйстве индустриально развитых стран мира, за исключением европейских государств. Общая площадь генетически модифицированных растений (ГМ-растений, ГМР) достигает 100 млн. га. Преимущественно возделываются растения, устойчивые к гербицидам (ГУ), насекомым-вредителям (Bt), болезням, а также с измененным составом определенных веществ, имеющих измененную продолжительность фаз развития (например, цветения и созревания) и другие (рис. 26). Устойчивые к гребицидам растения имеют название RR-растений, от слова Roundup Ready (Roundup – название гербицида). Название «Bt-растения» происходит от вида бактерии Bacillus thuringiensis, из которой выделен ген, кодирующий синтез токсина, убивающего насекомых. Мировой рынок представлен на рис. 27.

Механизм проявления устойчивости ГМР к определенным вредным объектам или проявления полезных свойств приведен на рис. 29-30.




Рисунок 26. Структура посевных площадей (2002 г), на которых в мире возделываются ГМ-растения с разными признаками.




Рисунок 27. Мировой рынок производства ГМ-растений.




Рисунок 28. Площади, занятые ГМР в отдельных странах и регионах.




Рисунок 28. Площади, занятые в мире отдельными видами ГМР.




Рисунок 29. Инактивация гербицида бромоксинила при помощи фермента нитрилазы бактерии Klebsiells ozaenae.





Рисунок 30. Глифосат (гербицид) ингибирует 5-енолпирувил-3фосфатсинтазу (EC 2.5.1.19), участвующую в шикиматном пути метаболизма фенолов. Фермент Bacillus licheniformis глифосат-N-ацетилтрансфераза преобразует молекулу глифосата в неактивную форму


Направления использования ГМР:

- устойчивость к гербицидам;

- устойчивость к насекомым;

- устойчивость к болезням;

- изменение пищевых свойств (состав масел, белка и др.);

- изменение физиологических свойств (изменение периода вегетации и др.);

- изменение окраски цветов, древесины, волокон хлопчатника и др.;

- увеличение содержания лекарственных веществ;

- снижение токсичности и аллергенности (никотина в табаке и др.);

- введение иммунизирующих белков (иммунизация против гепатита, папилломы (рака), геморрагической лихорадки и др.).


Фенотипические признаки ГМР представлены в табл. 6. К настоящему времени число фенотипических признаков существенно выше, учитывая все многообразие ГМР, полученных в лабораториях мира.

Гены, используемые для создания ГМР представлены в табл. 7. Число генов, использованных сегодня в создании ГМР также существенно больше, чем указано здесь.


Таблица 6. Фенотипическое проявление генетически обусловленных признаков у сельскохозяйственных культур


Культура

Фенотип

Гвоздика

Продолжительный период вегетации, устойчивость к сульфонмочевине и метсульфурон метилу

Измененный цвет венчика, устойчивость к гербицидам сульфонмочевине и метсульфурон метилу

Дыня

Замедленное созревание

Картофель

Устойчивость к колорадскому жуку

Устойчивость к колорадскому жуку, вирусу скручивания листьев

Устойчивость к колорадскому жуку, вирусу y

Кукуруза

Устойчивость к глифосату

Устойчивость к имидазолинону, имазетапиру

Устойчивость к кукурузному мотыльку, гербициду глифосат

Устойчивость к фосфинотрицину, к глюфосинату аммония

Устойчивость к кукурузному мотыльку, гербициду глифосат, к фосфинотрицину, глюфосинату аммония

Устойчивость к кукурузному мотыльку

Устойчивость к глюфосинату аммония, мужская стерильность.

Устойчивость к циклогексанону, сетоксидиму

Устойчивость к глюфосинату аммония, восстановленная фертильность.

Устойчивость к жуку диабротика (diabrotica sp.)

Лен

Устойчивость к сульфонмочевине, триасульфурону и метсульфурон метилу


Вектор для переноса генов в клетки картофеля сорта NewLeaf Y Shepody (плазмида PV-STMT15) содержит:

1) ген Cry3A (токсин бактерии Bacillus thuringiensis tenebrionis, Btt);

2) ген nptII (ген устойчивости к неомицину, фермент аминогликозид- 3'-фосфотрансфераза II, извлечен из кишечной палочки E. coli);

3) ген оболочечного белка вируса Y картофеля (PVYcp);

4) промоторы генов из вируса мозаики цветной капусты; вируса нароста инжира;

ген нопалинсинтазы Agrobacterium tumefaciens (возбудитель опухоли растений).

Токсичность белка Cry3A B. thuringiensis tenebrionis, Btt): для мышей – 5,22 г/кг живой массы, дождевых червей – 100 мг/кг сухой почвы.


Таблица 7. Генетические элементы для переноса и их источники


Направление

Гегнетический элемент

Источник гена

Состав липидов

Дельта(12)-дегидрогеназа жирной кислоты

Соя

Тиоэстераза

Лавр калифорнийский

Восстановление фертильности

Ингибитор РНК-азы

Bacillus amyloliquefaciens

Устойчивость к гербицидам

5-энолпирувилшикимат-3-фосфат синтаза

Agrobacterium tumefaciens

Кукуруза

Ацетолактат синтаза

Устойчивое к хлорсульфурону растение арабидопсиса или табака

Klebsiella pneumoniae ssp.ozanae

Глифосатоксидоредуктаза

Ochrobactrum anthropi

Устойчивость к насекомым

Cry1ab дельта-эндотоксин

Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki

Сry1f дельта-эндотоксин

Bacillus thuringiensis var. Aizawai

Сry3a дельта-эндотоксин

Bacillus thuringiensis subsp. Tenebrionis

Ингибитор протеаз

Картофель

Цвет венчика

Дегидрофлаванолредуктаза

Петуния

Мутации

Ацетолактат синтаза

Капуста, рис, пшеница, кукуруза

Содержание никотина

Никотин-нуклеотидфосфорилаза

Табак

Созревание

1-амино-циклопропан-1-карбоксилацид синтаза

Гвоздика

1-АЦК-1-карбоксилациддеаминаза

Pseudomonas chlororaphis

АЦК-циклаза синтаза

Томат

Устойчивость к вирусам

Репликаза

Лютеовирус картофеля

Белок оболочки вируса

Вирус мозаики огурца

Y вирус картофеля

Вирус мозаики дыни

Вирус мозаики цуккини



^ Лекция 12. Молекулярно-генетические процессы в клетке. Структура и функции основных биологических макромолекул.





оставить комментарий
страница3/4
Дата12.10.2011
Размер0,89 Mb.
ТипУчебно-методический комплекс, Образовательные материалы
Добавить документ в свой блог или на сайт

страницы: 1   2   3   4
средне
  1
отлично
  5
Ваша оценка:
Разместите кнопку на своём сайте или блоге:
rudocs.exdat.com

Загрузка...
База данных защищена авторским правом ©exdat 2000-2017
При копировании материала укажите ссылку
обратиться к администрации
Анализ
Справочники
Сценарии
Рефераты
Курсовые работы
Авторефераты
Программы
Методички
Документы
Понятия

опубликовать
Загрузка...
Документы

наверх