Сузуки Д., Куллис Т. Г97 Генетика / Бартон Гуттман, Энтони Гриффите, Дэвид Сузуки, Тара Куллис. Пер с англ. О. Перфильева icon

Сузуки Д., Куллис Т. Г97 Генетика / Бартон Гуттман, Энтони Гриффите, Дэвид Сузуки, Тара Куллис. Пер с англ. О. Перфильева


Смотрите также:
Религии австралии...
Дэвид М. Блокада Ленинграда, 1941 1944 [Текст] / Дэвид Гланц; [пер с англ. Е. В. Ламановой]...
Дэвид Дайчес
«хм «Триада»
Абдул-Баха. Ответы на некоторые вопросы. Пер с англ. Спб.: Единение, 1995. 234 с...
Перевод К. Семенов Редактор В. Трилис Пер с англ...
Г. И. Баренблатт; авт пер с англ изд., испр и доп., при ред участии В. М. Простокишина...
Указатель произведений литературы...
Новые поступления литературы (июль сентябрь 2002) математика инв. 62350 в 161. 8 Б 93...
Ялом И. Я 51 Лжец на кушетке / Пер с англ. М. Будыниной...
Ялом И. Я 51 Лжец на кушетке / Пер с англ. М. Будыниной...
Ялом И. Я 51 Лжец на кушетке / Пер с англ. М. Будыниной...



Загрузка...
страницы: 1   ...   5   6   7   8   9   10   11   12   ...   16
вернуться в начало
скачать
Генетика фагов

Макс Дельбрюк выбрал для своих исследований фаги, потому что они представляют собой очень простую биологическую систему: крохотные частички, которые могут воспроизводить себе подобных в других клетках и, как предполагалось, переносить некий генетический материал. Первый серьезный эксперимент с фагами провел Херши, доказав, что различные штаммы фага Т2 могут рекомбиниро-вать. Для этого ему, конечно, необходимо было выделить генетически разные штаммы, и первые обнаруженные им мутанты отличались формой стерильных пятен. Например, один из мутантов образует крупные пятна с четкими краями, и Херши обозначил его буквой r (от англ. rapidбыстрый, то есть быстро лизирующий мутант); мутанты tu {turbidмутный) образуют мутные пятна; а мутанты mi {minute — мелкий) — очень маленькие пятна. Все эти мутанты имеют отчетливо выраженный фенотип, то есть легко обнаружить образованные ими пятна, выделить их и вырастить штамм фагов с генотипом, отличающимся от дикого.

Бактерии можно заразить несколькими фагами одновременно. Херши заражал клетки мутантами r и tu, взятыми в достаточном количестве, чтобы почти каждая клетка была заражена фагами обоих типов. Большая часть потомства этих фагов принадлежала к типам r или tu, но появлялось также некоторое количество двойных мутантов r, tu и диких фагов. Таким образом, взаимодействовать могут даже ДНК вирусов, образуя в процессе кроссинговера рекомбинации. Херши использовал в своих экспериментах несколько независимых мутантов и, приняв частоту рекомбинаций между ними за условное относительное расстояние (как в классической генетике), смог расположить участки их мутаций на генетической карте. С тех пор эта карта была дополнена и расширена.

^ Тонкая структура гена

Сеймур Бензер исследовал тонкую структуру гена с помощью фагов Т4, среди которых ему удалось выделить редкие внутригенные рекомбинанты. Бензер сосредоточил внимание на классе мутантов rrII. Они растут и образуют большие стерильные пятна на штамме Е. coli В, но не растут на штамме Е. coli К. В отличие от них дикие формы rII+ растут и на В, и на К. Бензер обнаружил сотни новых мутантов rII,, которые оказались полезными не только для составления карты, но и для уточнения того, что же, собственно, представляет собой ген.

В типичном эксперименте по составлению карты штамм В бактерий заражают двумя различными мутантами rII и получают потомство, состоящее в основном из тех же двух типов мутантов, как и родители, но и, кроме того, из нескольких рекомби-нантов. Общее число фагов определяется в результате подсчета стерильных пятен на штамме В. Если выращивать потомство на штамме бактерий К, то мутан-тные типы вымирают и остаются только рекомби-нантные, так что появляется возможность установить более точное их соотношение1. Бензер доказал, что рекомбинации происходят в основном между аллелями внутри локуса rII, и смог определить генетическое расстояние между каждыми двумя му-тантными участками (сайтами) и даже составить карту этих аллелей. Небольшая часть этой карты выглядит следующим образом:



Каждый квадратик на карте означает аллель, отдельный от других аллелей; квадратики один над другим означают аллели, которые невозможно разделить, и, следовательно, они представляют собой мутации, возникающие в одной и той же позиции. Отсюда ясно, что Бензер создал карту, на которой ген можно поделить на различные участки, и каждый участок, по всей видимости, соответствует отдельной нуклеотидной паре ДНК.

Предложенная Бензером схема подтверждает также важное предположение о строении генов. Так как гены находятся в ДНК, было высказано предположение, что при синтезе белка последовательность оснований ДНК просто читается по порядку друг за другом. Но можно было предположить и другое: ген представляет собой отдельный «узел» ДНК, кодирующий белок каким-то более сложным способом. Результаты, полученные Бензером, доказывают, что ген обладает простой, линейной структурой, и это согласуется с самой простой гипотезой о функционировании ДНК.

^ Комплементация и определение границ гена

Эксперименты по составлению карт показали, что область rII состоит из многих мелких участков, или сайтов, в которых могут происходить разные мутации. Но такие карты дают представление только о строении гена и ничего не говорят о его функции. Даже неизвестно, состоит ли область rII из одного гена или нескольких. Для определения границ гена необходимы другие опыты, не имеющие ничего общего с кроссинговером и составлением карт даже если внешне эти опыты выглядят как эксперименты по составлению карт. Такие опыты называются комплементационными тестами, и их лучше всего объяснить при помощи модели.

Предположим, что мутации rII затрагивают два различных гена, которые расположены рядом, и что при мутации они оба дают одинаковый фенотип. Так как предполагается, что отдельный ген кодирует информацию о синтезе отдельного полипептида, то эти два гена должны кодировать синтез двух отдельных полипептидов, которые мы назовем А и В. Предположим, что оба гена необходимы для нормального функционирования в клетках К (для штамма В они несущественны). Тогда, если смешать клетки К с двумя различными мутантами, можно узнать, производятся ли оба белка. На рис. 8.2 показано, как различные мутации могут воздействовать на эти гены. Допустим, обе мутации происходят в гене А. Так как функциональный белок А не производится, то фаг расти не может. Теперь предположим, что одна мутация затрагивает ген А, а другая — ген В. Теперь в одном фаге имеется функциональный ген В, а в другом — функциональный ген А. Если клетку одновременно заразить этими двумя фагами, то они могут дополнить друг друга (то есть быть комплементарными друг другу): каждый выполняет функцию, отсутствующую у другого, и оба они могут расти. (Еще раз заметим, что эти тесты проверяют только функции генов, они не учитывают кроссинговер и рекомбинации.)

Когда Бензер заразил бактерии Е. coli К смесью мутантов rII, он получил именно те результаты, которые и предсказывала модель. Мутационные участки расположены вдоль линии и разделены на две группы.



Рис. 8.2. С помощью комплементационного теста можно определить, происходят ли две мутации внутри одного гена или нет. Бактерии одновременно заражают двумя фагами с двумя различными мутациями, которые затрагивают либо один ген (слева), либо два гена (справа). Если мутации затрагивают один ген, то ни в одном фаге не создается нормальной копии гена, поэтому фаги не могут размножаться. Но если мутации затрагивают оба гена, то один фаг имеет нормальный ген А, а другой нормальный ген В, и оба гена дополняют друг друга. Обратите внимание, что этот тест не имеет ничего общего с кроссинговером

Ни один из мутантов по левой группе не дополнял мутантов по этой же группе, и то же самое было с правой частью. В то же время любой мутант из левой группы оказывался комплементарным к любому мутанту из правой группы. Эти результаты доказывают, что область rII действительно включает в себя два гена. (Хотя Бензер называл отдельную функциональную единицу цистроном, сейчас цистроном называют то же, что и ген.) Комплементационные тесты, подобные этому, в наши дни применяют ко всем организмам, чтобы узнать, происходят ли две мутации внутри одного гена или нет, и определить таким образом границу между генами.

^ Что же такое ген!

Вернемся к определению гена. В классической генетике словом «ген» обозначалась единица генетического материала, выделяемая по трем критериям: по функции, мутации и рекомбинации. Изначально предполагалось, что ген — это функциональная единица, то есть нечто, определяющее отдельный признак. Такое представление сохранилось и до сих пор, но сейчас нам известно, что на один и тот же признак могут воздействовать различные гены и что при мутации гены могут давать один и тот же фенотип. Кроме того, ген определяли как единицу мутации. Эксперименты Бензера показали, что ген представляет собой линейную последовательность многих участков, в которых возможны разные мутации, и мы только что показали, как в комплементационных тестах можно выделять гены на основе происходящих в них мутаций. При этом ген понимается как последовательность, кодирующая синтез отдельной полипептидной цепи, и это представление основано на концепции Бидла и Тэй-тема «один ген — один фермент». Гены они определяли и как единицы рекомбинаций, хотя сейчас известно, что гены не представляют собой неделимые «бусины» на цепи, а рекомбинации происходят и внутри генов. Это и следовало ожидать, если предположить, что ген представляет собой всего лишь участок ДНК, любые нуклеотидные пары которой могут изменяться, в результате мутации и рекомбинаций.

В свете последних исследований, особенно секве-нирования (определения последовательности ДНК), приходится по-новому прдходить к вопросу о том что представляет собой ген. Так, оказалось, что в ДНК эукариот последовательности, кодирующие синтез белков, прерываются некодирующими последовательностями, называемыми интронами, которые удаляются непосредственно перед синтезом белка. Иногда на протяжении одного участка ДНК кодирующие последовательности, прерываемые интронами, сочетаются по-разному и кодируют разные белки. Если отождествлять отдельный ген с производством отдельного белка, то приходится признать, что одна и та же последовательность ДНК в таких случаях содержит несколько генов. Это только одна из трудностей. Другая состоит в том, что экспрессию, или «включенность», генов контролируют последовательности на участках ДНК, примыкающих к кодирующей последовательности, но не входящих в нее. Мутации в контролирующих участках могут привести к утрате геном функции, точно так же как и мутации внутри кодирующей последовательности. Поэтому, если выделять ген по критерию мутации, приходится признать, что контролирующие участки тоже относятся к гену. И наконец, подробный анализ ДНК-последовательностей целых геномов, включая и геном человека, предоставляют возможность опознать гены (по крайней мере, нечто вроде генов) на основании последовательности, а не мутаций. Белки со схожими функциями даже в очень отличающихся друг от друга организмах имеют много общего в строении. В настоящее время собраны обширные базы данных о ДНК-последовательностях, кодирующих белки; компьютерные программы могут просматривать все вновь определяемые последовательности и устанавливать возможные гены, предположительно кодирующие белки с теми или иными функциями. Даже если новая последовательность оказывается совсем не похожей на те, что уже имеются в базе, ученые все равно могут сделать вывод, что это ген, на основании хорошо известных признаков, общих для всех генов. Исходя из самого поверхностного анализа человеческого генома возможно предположить, что он содержит 30 000—50 000 генов, но если одна последовательность может включать более одного гена, то количество генов будет гораздо больше.

Генетические эксперименты Бензера и других ученых помогли составить представление о строении гена. Однако для любой науки характерно, что очередное открытие в отдельной области или технологии способно изменить основные ее положения. Для того чтобы функция генов стала более понятной, прочтите гл. 9, в которой более подробно объясняется, каким образом код ДНК преобразуется в структуру белка. Но прежде мы перенесемся через несколько лет и расскажем о другой процедуре составления карт, основанной на современном биохимическом анализе ДНК.

^ Рестрикционные ферменты и палиндромы

Бактерии и фаги, которые их атакуют, находятся в состоянии непрерывной химической войны. Бактерии, оказывающие сопротивление фаговой инфекции, получают преимущество в борьбе за существование, и они выживают с большей вероятностью. Точно так же фаги, преодолевающие защитные барьеры бактерий, получают определенное преимущество. Бактерии производят рестрикционные ферменты — эндонуклеазы (рестриктазы), которые атакуют молекулы ДНК, разрезая их фосфодиэфир-ные связи (эндо- означает, что они разрезают молекулу изнутри, а не по краям). Эти ферменты образуют рестрикционную систему, которая разрушает фаговые ДНК. Сейчас разработаны простые и быстрые методы определения последовательности молекул ДНК. Секвенирование ДНК показывает, что каждая эндонкулеаза очень специфична и что она разрезает только очень короткую последовательность ДНК, чаще всего так называемый палиндром. Палиндром — это последовательность букв, которая одинаково читается как обычным способом, так и задом наперед подобно известным фразам: «А роза упала на лапу Азора» или «А кит на море — романтика!» Молекулярный палиндром — это последовательность оснований, которая также читается одинаково в любом направлении, например:

3'-GAATTC-5' или 5'-CTTAAG-3'.

Фермент, атакующий именно эту последовательность, синтезируется штаммом Е. coli RY13, так что если фаг с такой последовательностью попытается атаковать бактерию, фермент разрежет его ДНК на фрагменты и остановит инфекцию. На рис. 8.3 указаны последовательности, которые подвергаются атаке со стороны ферментов, выделенных из различных типов бактерий. (Источник каждого фермента обозначен трехбуквенным сокращением по названию бактерии, например, фермент, выделенный из Е. coli RY13, называется EcoRI.)

Почему в таком случае бактерии не разрушают собственную ДНК? В них параллельно рестрикци-онной включается модификационная система, ферменты которой добавляют метиловую группу (СН3) к аденинам последовательности, блокируя тем самым действие рестрикционной эндонуклеазы. Некоторые фаги добавляют метиловую группу к своей ДНК и становятся невосприимчивыми к такой эн-донуклеазе.



^ Секвенирование ДНК

ДНК можно поделить на фрагменты во время электрофореза (рис. 8.3). При этом используют вещество агарозу, похожее на агар, который используют в качестве питательной смеси. Смесь молекул ДНК помещают на гель агарозы. Когда через гель пропускают электрический ток, отрицательно заряженные молекулы ДК устремляются к положительному полюсу и более мелкие молекулы движутся быстрее. Этот метод настолько чувствителен, что с его помощью можно определить длину молекулы



Рис. 8.3. Молекулы ДНК можно легко разделить электрофорезом в геле арагозы. Чем меньше фрагмент, тем быстрее он перемещается

вплоть до отдельного основания. Увидеть распределение молекул можно, нанеся на гель краситель, который связывается исключительно с ДНК. Основной принцип определения последовательности, или секвенирования, ДНК исходит из двух главных положений. Во-первых, синтез цепи ДНК начинается с короткого участка-лраймера (затравки) и продолжается в направлении 5'—>3'; во-вторых, очередной нукпеотид добавляется к цепи, только если у рибозы на конце имеется атом кислорода в позиции 3'. Однако можно синтезировать дидезоксинуклеотиды (ddN) без этого атома кислорода; их можно включать в растущую цепь, но только после них другие нуклеотиды включаться не будут и рост цепи прекратится. Поэтому ученые начинают с отдельной цепи ДНК, к которой добавляют короткую комплементарную затравку, ДНК-полимеразу и смесь четырех нуклеотидов, необходимых для синтеза ДНК. (В смеси содержится достаточное количество каждого рода вещества.) Обычно конец 5' помечается 32Р, поэтому можно определить местонахождение ДНК с помощью авторадиографии. Затем эту смесь разделяют на четыре пробирки. В одну добавляют немного ddA, в другую — ddC, в третью — ddG, в четвертую ddT. Синтез комплементарной цепи ДНК происходит в каждой пробирке, удлиняя начальные цепочки-затравки, но рост каждой молекулы заканчивается тогда, когда к ней случайным образом присоединяется дидезоксинуклеотид. Поэтому если в последовательности имеется, например, десять положений для ти-мина Т, то в большинстве из них окажется обычный тимин dT, при этом добавленного ddT хватит, чтобы создать молекулы десяти различных размеров, каждая из которых заканчивается тимином. Если вещество из пробирки ddT поместить в гель, то при электрофорезе молекулы ДНК разделятся на десять частей и образуют десять полосок. То же самое произойдет и с молекулами ДНК из других пробирок. Полную последовательность ДНК можно прочитать, начиная непосредственно с самой дальней полоски и заканчивая самой ближней (рис. 8.4).


Последовательность



Рис. 8.4. Один из методов определения последовательности молекулы ДНК

В четырех пробирках синтезируются цепи ДНК, комплементарные очищенным одиночным цепям, причем в каждой пробирке содержатся различные дидезоксинуклеотиды. Получившиеся фрагменты распределяют в зависимости от размера и всю последовательность прочитывают по распределению полос.

^ Рестрикционное картирование

Сейчас известно и доступно для применения множество типов рестрикционных ферментов. Они разрезают ДНК на различные последовательности, и их можно использовать для анализа структуры ДНК и составления хромосомных карт методом рестрикционного картирования. На рестрикционной карте отмечено относительное расположение участков {сайтов рестрикции), которые вырезают различные нуклеазы. С помощью других методов можно сопоставить эту карту с генетической картой. В данном случае применяют технологию электрофореза, описанную во вставке (с. 216—218), с помощью которой разделяют ДНК на фрагменты и определяют их относительный размер. Рестрикционное картирование лучше объяснить на примере. У многих вирусов животных имеются маленькие кольцевые ДНК. Предположим, мы выделили ДНК вируса длиной в четыре килобазы (kb) и порезали ее ферментом ЕсоRI на фрагменты. Пропустив их через гель, мы определили их длину: 0,4; 0,8; 1,3 и 1,5 kb. Это значит, что в геноме находится четыре участка рестрикции EcoRl, которые могут располагаться по-разному.

Порежем вирусную ДНК снова при помощи EcoRI, но на этот раз уменьшим время обработки ДНК ферментом, чтобы некоторые ДНК были порезаны не полностью. Наряду с прежними четырьмя фрагментами получаем новые фрагменты длиной 1,7; 1,9; 2,1 и 2,3 kb. Небольшой перебор вариантов показывает, что эти фрагменты располагаются в следующем порядке:



Можно подтвердить такое расположение, выделив более крупные фрагменты, порезав их EcoRI и убедившись, что они в итоге разрезаются на те же малые фрагменты.

Далее обработаем ту же вирусную ДНК ферментом SaiI, в результате чего получим фрагменты длиной 0,95; 1,25 и 1,8 kb. Получается, что в этой ДНК три участка SaiI. Затем выделим эти фрагменты и порежем их EcoRI:

фрагмент 0,95 kb → 0,1 kb + 0,85 kb;

фрагмент 1,25 kb→0,2 kb + 0,4 kb + 0,65 kb;

фрагмент 1,8 kb→0,7 kb + 1,1 kb.

Перебор вариантов показывает, что участки SaiI располагаются относительно участков EcoRI следующим образом:

Если полученных данных недостаточно для определения взаимного расположения участков, то можно еще раз порезать фрагменты одним ферментом, а затем другим, или, допустим, порезать ДНК при помощи сначала EcoRI, а затем SaiI. После этого можно применить третий фермент и определить расположение его участков рестрикции относительно первых двух. Это очень простой пример. На практике дело обстоит гораздо сложнее даже в случае с самыми маленькими вирусами, которые требуют более сложных схем анализа, но принцип анализа сохраняется.

Эту же технологию можно применять для диагностики наследственных нарушений по ДНК зародышевых клеток. Обнаружилось, что фермент Hpal режет нормальную ДНК на фрагменты одной длины, а ДНК с аллелями серповидноклеточной анемии гена бета-гемоглобина — на фрагменты другой длины; в 87% случаев серповидноклеточной анемии получаются более длинные фрагменты. Это значит, что дефектный участок гена с мутацией HbS не соответствует последовательности фермента Hpal. При помощи этого метода возможно определять 87% случаев серповидноклеточной анемии непосредственно на стадии эмбрионального развития.

Рестриктазы используют и в других анализах. Во всех биологических видах наблюдается некоторое разнообразие в последовательности ДНК различных особей, и иногда такое разнообразие приводит к удалению или вставке дополнительных участков рестрикции. Обычно это нейтральные вариации, не оказывающие влияния на фенотип (в отличие от вариации гена гемоглобина). Такие вариантные участки оказываются весьма полезными при составлении карт, потому что они говорят об альтернативной форме хромосомы с наличием или отсутствием дополнительного участка рестрикции:



Молекулярный анализ легко обнаружит эти различия, потому что если эту последовательность ДНК разных индивидов порезать рестриктазой, то в одном случае получится один длинный фрагмент, а в другом — два коротких, общая длина которых соответствует длине первого. Таким образом выявляются два морфа в популяции: у некоторых индивидов имеется дополнительный участок рестрикции, а у других его нет. Такое явление называется полиморфизмом длины рестрикционных фрагментов (RFLPrestriction fragment length polymorphism). Его полезно учитывать при составлении карт, потому что этот полиморфизм служит нейтральным гетерозиготным маркером, с помощью которого можно определять близлежащие гены, особенно при составлении карт маркеров, приводящих к разным фенотипам. Кроме того, если RFLP расположен близко от дефектного аллеля, то его можно использовать для обнаружения этого аллеля подобно участку рестрикции внутри гена гемоглобина. В геноме встречаются и другие типы нейтральных вариаций последовательности, и RFLP оказался первым среди открытых учеными. Все они могут быть использованы для составления карт и обнаружения рецессивных дефектных аллелей.

Глава девятая ^ РАСШИФРОВКА КОДА ЖИЗНИ

Как только Уотсон и Крик предложили свою модель ДНК, ученые поняли, что линейная последовательность оснований ДНК составляет ряд ключевых слов, или кодонов, соответствующих линейной последовательности аминокислот в белках. Кроме того, как заметил Крик, поскольку и ДНК, и белки представляют собой линейные последовательности элементов, обе последовательности должны быть колинеарными. Это значит, что первый кодон гена должен кодировать синтез первой аминокислоты, второй ген — второй аминокислоты и т. д. Оставалось только логически выяснить, какие именно сочетания четырех оснований A, G, С и Т образуют эти кодоны.

Белки состоят из 20 видов аминокислот. Предположим, что кодону соответствуют последовательности из двух оснований, например АА или СТ. Так как оснований всего четыре, получается: 4 х 4 = 16 сочетаний. Этого недостаточно для 20 аминокислот. Далее предположим, что кодон — это триплет, то есть последовательность из трех оснований. Теперь получается: 4 х 4 х 4 = 64 сочетания, то есть больше 20. В таком случае либо 44 триплета являются бессмысленными, либо мы имеем вырожденный код. Термин «вырожденный код» обозначает код, в котором разные знаки могут иметь одно и то же значение. Некоторое время серьезно обсуждался и другой механизм кодирования, в котором одни основания могли передавать код, а другие — служить «запятыми», отделяющими одни ко-доны от других.

Как узнать, какая из предложенных схем верна? Крик с коллегами провел серию блестящих опытов на мутантах rII фага Т4, потому что мутанты и дикие типы фагов отличить друг от друга легко (вспомним, что мутанты rII не растут на штамме К). В экспериментах применялся мутагенный краситель профлавин, молекулы которого вставляются между парными основаниями двойной спирали ДНК. При репликации и рекомбинации получаются молекулы со вставкой или с удалением нескольких нуклеотидов. Для простоты будем считать, что каждая мутация в результате действия профлавина вставляет или удаляет только одно основание.

Не осознавая этого при чтении текста, мы пользуемся так называемой рамкой считывания. Это своего рода прямоугольник, который передвигается вдоль слов, определяя их границы, обозначенные пробелами. Рамка постоянно сужается или раздвигается в зависимости от длины слова, но если предположить, что все слова состоят, например, из 3 букв, то ширина рамки будет постоянной. С помощью такой рамки легко прочитать следующие осмысленные слова:

КОТ ТОМ ЕЩЕ МАЛ УХО УСЫ НОС,

даже если между ними не будет пробелов. Теперь предположим, что в одно из слов попала лишняя буква; тогда рамка считывания сдвинется и получатся слова:

КОТ ТОМ СЕЩ ЕМА ЛУХ ОУС ЫНО С

и так далее. После вставки получаются бессмысленные слова, но какой-то смысл восстановить можно, если компенсировать вставку удалением другой буквы, возвращающим рамку считывания в нормальное положение:

КОТ ТОМ СЕЩ ЕМЛ УХО УСЫ НОС.

По крайней мере, можно прочитать слова «ухо», «усы» и «нос», несмотря на бессмыслицу в середине фразы.

Приблизительно так же в ДНК строится последовательность кодонов из трех оснований, и мутация со сдвигом рамки может переместить рамку считывания в том или другом направлениях, которые мы обозначим как П и Л (правая и левая стороны). Именно из этого исходили Крик и его коллеги, приступая к экспериментам. Они начали с одного вызванного профлавином мутанта под названием FC0, произвольно обозначив его как вызывающий сдвиг в направлении П. Потом они смогли выделить компенсирующих мутантов Л. Так как FC0 является мутантом гII, он не может расти на штамме К; но если фаги FC0 еще раз подвергнуть мутации посредством профлавина и поместить их в среду со штаммом К, то некоторые фаги образуют стерильные пятна, потому что у них произошла компенсирующая мутация Л. Такую вторую мутацию называют супрессорной (подавляющей), или супрессором. Супрессор — это мутация, которая компенсирует эффект другой мутации. Так ученые выделили ряд супрессоров (обозначив их как FC1, FC2 и т. д.) и скрестили двойные мутанты (имеющие одновременно мутации П и Л) с дикими фагами, изолировав Л-мутантов. Так как FC1, FC2 и другие все были Л-мутантами, то их супрессоры по определению должны были быть П-мутантами. Так, передвигаясь «взад» и «вперед», Крик с коллегами получили ряд П-мутантов и ряд Л-мутантов.

Уже сама возможность выделять таких мутантов подтверждает истинность модели, но нужно было провести еще два важных опыта. Во-первых, любой Л-мутант должен был подавлять любого П-мутан-та (по крайней мере, если их участки располагаются близко друг от друга), а группа Крика получила много таких парных комбинаций. Ученые обнаружили, что за несколькими исключениями двойные мутанты, содержащие по одной П- и Л-мутации походили на фагов дикого типа. Но самым впечатляющим был эксперимент с получением тройной Л- или П-мутации. Легко доказать, что если код действительно состоит из триплетов, то сдвиг на три буквы влево или право восстанавливает рамку считывания. Именно так и получилось: тройной П- или Л-мутант обычно имели дикий фенотип, если мутации происходили близко друг от друга. Эти опыты послужили убедительным доказательством того, что генетический код состоит из триплетов и читается без «запятых», посредством рамки считывания.

Более того, эта система функциональна только в случае с вырожденным кодом, так как между участками мутаций П и Л или между тремя П-мутациями подряд образовывалось несколько неправильных триплетов. Но фенотип в общем случае оказывался «диким», потому что 64 триплета (или, по меньшей мере, их большинство) кодируют производство какой-либо аминокислоты. Даже если в двойном или тройном мутанте оказывалось несколько неправильных кодов, белки с несколькими «неправильными» аминокислотами получались вполне функциональными. Если бы кодонами были только 20 триплетов, а остальные 44 оказались бессмысленными, то случайная мутация, вероятнее всего, создавала бы бессмысленные кодоны, и синтез белка останавливался бы всякий раз,подходя к такому «пустому месту». Поскольку обычно этого не происходит, код должен быть вырожденным. В действительности, как мы увидим, бессмысленными являются только три из 64 кодонов.

^ Как строятся белки?

Итак, информация, определяющая порядок аминокислот в белке, хранится в ДНК в виде ряда триплетных кодонов. Но как последовательность оснований ДНК превращается в реальный продукт? Конечно, чертежи и схемы для строительства очень важны, но для построения здания требуется ряд сложных операций.

Строение клеток эукариот накладывает на такие операции некоторые ограничения. ДНК хранится в хромосомах, располагающихся в ядре, а белки синтезируются в цитоплазме, в органеллах — рибосомах, которые по большей части покрывают мембраны эндрплазматической сети (рис. 9.1). Если ДНК содержит чертежи для строительства белков, а сама «стройка» располагается в цитоплазме, то, как чертежи попадают на стройку? Это все равно, что получить важную формулу из редкой книги, которую не позволяют выносить из библиотеки.



Рис. 9.1. Эндоплазматическая сеть клеток эукариот состоит из мембран, обычно расположенных параллельно друг другу и покрытых крохотными частицами рибосомами, которые служат фабриками по производству белка

В этом случае нужно сделать фотокопию и принести фотокопию в мастерскую. Точно так же обстоит дело и в клетке. Копией служит РНК.

^ Молекулы РНК: инструменты для синтеза белка

В 1940-х годах, когда ученые еще недостаточно хорошо представляли строение нуклеиновых кислот, были получены доказательства того, что синтез белков всегда сопровождается синтезом рибонуклеиновой кислоты (РНК). Как было показано в гл. 7, РНК отличается от ДНК тем, что вместо сахара дезоксирибозы она включает в себя сахар рибозу, что она, как правило, состоит из одной цепи, что место тимина в ней занимает урацил. Но по своей структуре урацил походит на тимин, и он может связываться с аденином и образовывать пару A—U вместо пары А—Т в ДНК. Одиночная цепь РНК может складываться и образовывать двойные участки, удерживаемые вместе парами оснований A—U и G—С.

Почему получилось так, что в живых организмах содержатся два вида нуклеиновых кислот, похожих друг на друга, но вместе с тем и разных? Согласно одному из мнений РНК и ДНК естественным образом появились из «первичного бульона», на ранних этапах эволюции живой материи. Таким образом, вопрос сводится к тому, насколько полезными они были для первобытных клеток? Имеются доказательства того, что геном первобытных клеток состоял из РНК, а не из ДНК. Со временем по неясным причинам геномная РНК уступила свое место ДНК. В процессе отбора две молекулы приобрели каждая свою специализацию: ДНК переносит генетическую информацию, а РНК служит посредником для синтеза белка.

Надежное свидетельство того, что РНК переносит информацию от ДНК в цитоплазму, было получено в ходе опытов с использованием быстрооб-менивающихся радиоактивных меток. Такого рода эксперименты позволяют проследить за перемещением вещества, подобно тому, как за перемещением воды в реке можно наблюдать по окрашенному пятну. Клетки эукариот подвергаются быстрому воздействию уридина (это нуклеотид с урацилом), помеченного тритием, радиоактивным изотопом водорода (3Н-уридин). Уридиновая метка встраивается в любую РНК, которую синтезирует клетка за этот период. Из-за краткого времени воздействия такую метку называют быстрой, или пульсовой. После этого 3Н-уридин растворяют в большом количестве немеченого уридина. Затем начинают следить за меченой РНК, удаляя через разные промежутки из раствора часть клеток и подготавливая их к авторадиографии. Темные пятна, оставленные электронами, испускаемыми атомами трития, указывают на местоположение РНК. Вначале все метки содержатся в ядре. Затем их количество в ядре уменьшается, но увеличивается — в цитоплазме. Это говорит о том, что РНК переходит из ядра в цитоплазму. Чем больше времени прошло после прекращения периода мечения, тем меньше остается меток. Это говорит о том, что РНК, образуемая в период мечения, со временем разлагается, то есть она нестабильна. Таким образом, клетка образует РНК, использует ее в течение некоторого времени для каких-то целей, а затем расщепляет.

Другое доказательство было получено в ходе работ Эллиота Волкина и Лоренса Астрачана, изучавших нуклеиновые кислоты, образующиеся в бактериальных клетках после инфицирования фагом. Им удалось выделить новый вид РНК, состав которой удивительно похож на состав фаговой ДНК, но отличается от бактериальной ДНК. Эта РНК также быстро разлагается.

Для нуклеиновых кислот характерным показателем служит так называемое отношение оснований (А + T)/(G + С). Для ДНК разных организмов этот показатель очень сильно различается, и с его помощью можно идентифицировать близкородственные виды, а также классифицировать их на том основании, что у близких видов должны быть похожие ДНК. В отличие от ДНК у РНК этих организмов отношение оснований довольно постоянно. Основная доля их РНК приходится на рибосомную РНК (рРНК), то есть на те большие молекулы, которые составляют основу рибосом. Рибосома — это довольно большая внутриклеточная частица, состоящая из двух неравных частей. Каждая часть состоит из 30— 40 различных белков. Некоторые из них являются ферментами, помогающими выстраивать аминокислоты в новую белковую цепь. Они присоединяются к длинным молекулам рРНК, так что вся рибосома похожа на неправильную ягоду малины или ежевики. Среди других РНК большинство составляют молекулы гораздо меньшего размера, которые называются транспортными РНК (тРНК) (их функцию в процессе синтеза белка мы объясним далее). Но эти РНК быстро не разлагаются и после своего образования могут длительно существовать. По-видимому, вещество, обнаруженное Астрачаном и Вол-кином, и вещество, помеченное быстрообмениваю-щимися метками в клетках эукариот, были разными видами РНК. Сидней Бреннер, Франсуа Жакоб и Мэтью Меселсон провели другой эксперимент с метками, доказав, что РНК, образуемая после инфекции фага, на небольшой промежуток времени присоединяется к рибосоме, а потом разлагается. Они предположили, что эта РНК должна переносить информацию от фаговой ДНК к рибосомам, и назвали ее информационной, или матричной, РНК (мРНК). Рибосомы представляют собой всего лишь фабрики по производству белка. Они временно присоединяются к матричной РНК, которая программирует их на синтез отдельного белка.

РНК-транскрипция

Сейчас доказано, что РНК образуется в результате того же спаривания комплементарных оснований, с помощью которого образуется и двойная спираль ДНК из одинарной цепи (рис. 9.2). Этот процесс называется транскрипцией. Его выполняет особый сложный фермент — РНК-полимераза. Возле каждого гена располагается участок — промотор с последовательностью оснований, к которым присоединяется РНК-полимераза, или, как говорится, которые она распознает.



Рис. 9.2. В процессе транскрипции на одной из цепей ДНК образуется комплементарная ей цепь РНК. Этот процесс похож на синтез новой цепи ДНК во время репликации, но со следующими отличиями: а) копируется только одна цепь ДНК; б) синтезируется РНК, а не ДНК; в) процесс происходит при помощи фермента РНК-полимеразы

Затем полимераза слегка приоткрывает двойную спираль и движется вдоль гена, нуклеотид за нуклеотидом, синтезируя молекулу РНК с последовательностью оснований, комплементарных одной из цепей ДНК, служащей матрицей. При этом урацил U образует пару с аде-нином А, а цитозин С — с гуанином G. Получившаяся молекула называется транскриптом. Последовательность оснований транскрипта идентична комплементарной цепи ДНК, то есть кодирующей цепи, за исключением того, что место тимина занимает урацил. Относительно простой процесс транскрипции, описанный здесь, происходит в бактериях. Процесс образования мРНК эукариот несколько сложнее, о чем говорится в гл. 11.

С развитием электронной микроскопии стало возможным наблюдать процесс транскрипции непосредственно (рис. 9.3). Транскрипцию можно осуществлять и in vitro, в пробирке, то есть искусственно, при участии выделенной из клеток ДНК, РНК-полимеразы и четырех видов нуклеотидов РНК.

Убедительное доказательство комплементарности последовательности оснований ДНК и РНК было получено в ходе экспериментов по гибридизации нуклеиновых кислот. В 1960 году Поль Доти и Джулиус Мармур обнаружили, что при высокой температуре водородные связи между основаниями двух цепей ДНК разрываются, так что ДНК денатурирует, и ее цепи отделяются друг от друга. Если раствор денатурированной ДНК медленно охлаждать, то одинарные цепи со временем находят комплементарные цепи и снова образуют стабильные двухцепочечные молекулы. Если во время такого охлаждения, или «отжига», добавить одноцепочечные молекулы РНК, то образуются также и гибридные молекулы ДНК—РНК, но для этого требуются молекулы, полностью комплементарные цепям ДНК.



Рис. 9.3. Электронная микрофотография транскрипции РНК. ДНК имеет вид тонкой нити, проходящей через центр каждого участка, похожего по форме на перо. От ДНК отходят молекулы РНК: транскрипция самых длинных уже почти закончилась, транскрипция самых коротких только началась. Это рибосомные РНК, которые входят в структуру рибосом

Обычно в ходе таких экспериментов денатурируют ДНК и пропускают раствор одинарных цепей через нитроцеллюлозные фильтры. Если на эти фильтры нанести раствор меченой РНК, то РНК-транскрипты с комплементарными последовательностями соединятся с ДНК, и их можно будет легко обнаружить измерив радиоактивность фильтра. Молекулы РНК, не имеющие комплементарной последовательности, не соединятся с ДНК и пройдут через фильтр. В молекуле ДНК две цепи. Мы показали, как одна из цепей служит матрицей для РНК-полиме-разы, которая строит РНК. Но что если матрицей для разных РНК в разное время служат разные цепи ДНК? Джулиус Мармур попытался дать ответ в эксперименте с фагом SP8. ДНК этого фага представляет собой одну двойную молекулу, цепи которой сильно отличаются по плотности (чем больше гуанина в цепи, тем она плотнее), поэтому их легко разделить в растворе CsCl с градиентом плотности. Выяснилось, что РНК, образовавшаяся после инфицирования SP8, образует гибриды только с одной из цепей. Это доказывает, что матрицей для синтеза РНК служит только одна цепь ДНК. В случае с другими вирусами и большинством остальных клеток оказалось, что для синтеза РНК используются различные участки разных цепей ДНК, но, как правило, на протяжении отдельного участка транскрибируется только одна цепь. Этого и следовало ожидать, так как молекулы РНК, транскрибированные с комплементарных цепей одного гена, кодировали бы совершенно разные белки, и только один из них был бы функциональным белком этого гена.

Теперь, в свете всего сказанного, следует несколько расширить понятие гена, так как в клетках имеются два типа генов. Большинство генов кодируют информацию для синтеза специфического вида белка; транскриптами с этих генов служат мРНК, которые и заведуют синтезом белка. В ДНК также должны быть включены последовательности для синтеза стабильных рибосомных и транспортных РНК, поэтому в геноме содержатся гены для рРНК и тРНК. Продуктами этих генов служат не белки, а РНК-транскрипты, стабильные компоненты клеток, составляющие часть аппарата по синтезу белка, как будет показано далее.

Трансляция

Перенос информации с ДНК на РНК называется транскрипцией, а перенос этой информации с мРНК в белок — трансляцией. Обычно матричные РНК в течение некоторого времени программируют рибосомы на производство определенного белка, а затем разрушаются. Рибосома сама устанавливает рамку считывания, пропуская мРНК между своими половинами и передвигая мРНК по три основания за раз, начиная с 5'-конца и заканчивая 3'-концом. Одна молекула мРНК может проходить одновременно через несколько рибосом, которые синтезируют один вид белка друг за другом. Несколько рибосом, присоединенных к одной мРНК, называются полирибосомой.

Каждая мРНК содержит серию кодонов, скопированных с ДНК, но в аминокислотах нет химических структур, которые распознавали бы нужные кодоны. Тут в действие вступают транспортные РНК (рис. 9.4). В каждой клетке имеется по меньшей мере по одному виду тРНК для каждой из 20 аминокислот. В клетке также содержится 20 разных видов ферментов (аминоацил-РНК-синтетаз), по одному на каждую аминокислоту. Каждый фермент распознает строго определенную тРНК вместе с соответствующей ей аминокислотой и соединяет их. В результате получается аминоацил-тРНК. Три основания тРНК образуют антикодон, комплементарный кодону мРНК, так что каждая аминоацил-тРНК может подсоединяться к мРНК в нужном месте.



^ Рис. 9.4. Общая структура молекулы транспортной РНК. Обратите внимание на значительные внутренние сгибы, образованные парами GC и AU. Аминокислота присоединяется к одному концу, а на другом конце располагается петля с антикодоном, который распознает кодон матричной РНК. Структуры некоторых оснований слегка изменены добавлением небольших химических групп, таких как гидроксильная и метильная группы

Трансляция (рис. 9.5) начинается с того, что мРНК входит в рибосому. Кодоны мРНК распознаются по очереди, и тРНК подводят к ним соответствующие аминокислоты. Так образуется полипептидная цепь, последовательность аминокислот в которой определяется последовательностью кодонов. Важно отметить, что трансляцию одновременно производят две тРНК. Аминокислота одной тРНК соединяется с аминокислотой другой, после чего первая тРНК отсоединяется. После этого рибосома передвигает мРНК на один кодон дальше; вместе с этим перемещается и вторая тРНК, освобождая место для третьей тРНК. Затем процесс повторяется, и так полипептидная цепь растет шаг за шагом, причем очередная новая аминокислота всегда присоединяется к последней тРНК. (Когда производство белка заканчивается, эта цепь прерывается.) Это довольно точная модель трансляции, хотя некоторые подробности еще ждут своего объяснения.

^ Сложные гены эукариот

Когда исследователи начали изучать гены различных белков в клетках эукариот, обнаружилось, что взаимодействие генов и белков в этих организмах более сложное, чем взаимодействие генов и белков прокариот. Первые примеры такого взаимодействия были получены в 1977 году в лабораториях Филипа Шарпа и Пьера Шамбона. Вместе со своими коллегами они гибридизировали мРНК различных генов с теми ДНК, с которых были сняты эти информационные копии. У бактерий последовательность мРНК идентична последовательности кодирующей цепи ДНК (за исключением того, что место тимина занимает урацил), поэтому структура гибридных молекул была достаточно проста.



Рис. 9.5. Общие принципы синтеза белка. Информационная (матричная) РНК входит в рибосому так, чтобы первые два ее основания могли соединиться с двумя молекулами ами-ноацил-тРНК. К этому участку подходят две аминоацил-тРНК, кодоны, которых комплементарны кодонам мРНК. Затем первая аминокислота соединяется со второй пептидной связью, первая тРНК отсоединяется, и дипептид остается прикрепленным ко второй тРНК. Вместе с тем мРНК сдвигается на следующий «шаг» в рибосоме, после чего к ее третьему кодону может присоединиться третья тРНК. Между второй и третьей аминокислотой образуется пептидная связь, и весь процесс повторяется (обычно несколько сотен раз) до кодона мРНК, означающего остановку, после чего сформированный белок отсоединяется

Но когда под электронным микроскопом были сделаны снимки гибридных молекул генов эукариот, то в них обнаружился ряд петель. Это значит, что мРНК и ДНК имеют не совсем идентичную последовательность, и петли были как раз теми местами, в которых они не могли соединяться. Когда последовательность мРНК сравнили с последовательностью ДНК, стало понятно, что кодирующая последовательность генов в некоторых местах прерывается некодирующей последовательностью, то есть некоторые нуклеотиды не кодируют синтез белка. Впоследствии выяснилось, что это типичная картина для ДНК эукариот. Кодирующая последовательность гена называется эк-зоном, а некодирующая последовательность — ин-троном. Некоторые гены имеют в своей структуре несколько интронов. Часто обнаруживают и такие гены, в которых больше интронов, чем экзонов.

В общем случае при транскрипции генов эукариот образуются большие молекулы РНК, содержащие как экзоны, так и интроны. После этого особые комплексы ферментов (сплайсингсомы) вырезают из транскрипта все интроны и соединяют экзоны в одну мРНК, кодирующую производство белка. Далее эта РНК транслируется как обычно.

Причины, по которым природа придерживается такой структуры, до сих пор не ясны, но ее можно объяснить как с эволюционной точки зрения, так и с точки зрения развития организма. Если говорить об эволюции, то такая структура ценна тем, что позволяет экспериментировать с генами и создавать новые гены. Кроссинговер может происходить внутри интронов, и в таком случае ошибки будут несущественными, а при рекомбинации могут образоваться новые экзоны и как следствие новые белки. Часто бывает так, что отдельный экзон кодирует отдельную область, или домен, белка, то есть отдельную часть белка с особыми функциями. Поэтому включение в ген нового экзона приведет к созданию белка с новыми областями и, возможно, с новыми функциями. Такое изменение генетической структуры может служить источником эволюции.

С точки зрения развития организма структура интрон-экзон ценна тем, что позволяет одноц нуклеотидной последовательности кодировать синтез более одного белка. Сейчас известны случаи, когда интроны в разных тканях режутся по-разному, и в результате синтезируются разные белки с разными функциями. Поэтому такая структура предоставляет возможность осуществить рост новых типов клеток с минимальным изменением информации.

Хромосомы эукариот содержат не только избыточную ДНК в виде интронов, но и повторяющуюся ДНК, которая не кодирует белки или стабильные молекулы РНК. Например, около 10% ДНК мыши приходится на ДНК с высоким содержанием повторяющихся элементов, то есть эти участки содержат короткие последовательности, длиной не более 10 нуклеотидных пар, повторяющихся миллионы раз. Еще 20% приходится на ДНК с умеренным содержанием повторяющихся элементов, то есть эти участки содержат последовательности из нескольких сотен нуклеотидов, повторяющиеся тысячи раз. Таким образом, очень большая часть хромосом эукариот состоит из ДНК, которая может подвергаться мутациям и рекомбинациям без выраженного эффекта. (О повторяющейся ДНК в геноме человека говорится в гл. 12.)

^ Генетический словарь

К 1962 году благодаря работам Крика и его коллег, о которых говорилось ранее, было установлено, что генетический код состоит из триплетов. После этого перед исследователями встала другая непростая задача: определить, какие именно аминокислоты кодирует тот или иной триплет. Как часто бывает, открытие было сделано почти случайно, после чего весь код был расшифрован за несколько лет — одно из величайших достижений молекулярной биологии! В 1961 году Маршалл Ниренберг и Филипп Ледер разрабатывали методы искусственного синтеза белка, смешивая рибосомы, источники энергии, активирующие ферменты, тРНК и другие компоненты. В одну из контрольных смесей, синтез белка, в которой не ожидался, они добавили искусственную РНК, состоявшую исключительно из ураци-ла, то есть полимера с нуклеотидной последовательностью U—U—U—U—U-, называемого полиури-диловой кислотой. Вопреки ожиданиям эта кислота повела себя, как информационная РНК, и стимулировала синтез белка. В такой среде с полиуридило-вой кислотой синтезировался только полифенил-аланин, то есть последовательность U—U— U должна была кодировать производство одной аминокислоты, а именно фенилаланина.

После этого открытия началось настоящее состязание между лабораториями Ниренберга и Северо Очоа, в которых с помощью синтетических РНК старались подобрать код к каждой аминокислоте. Поскольку фермент, создающий такие синтетические молекулы, соединяет основания в случайной последовательности, поначалу приходилось полагаться на статистический анализ получающихся полипептидов. Настоящий прорыв был сделан только тогда, когда Ниренберг и Генрих Матей попытались синтезировать мини-мРНК с тремя нуклеотидами в известной последовательности. Обнаружилось, что в искусственной среде каждый из этих триплетов присоединялся к рибосоме и распознавался только одним видом тРНК. Исходя из этого, легко было узнать, какие аминокислоты кодировались тем или иным триплетом. Исследователи выяснили, что UUU и UUC (если читать их в направлении 5→3'), например, присоединяют к себе тРНК фенилаланина, GUU — тРНК валина, UUG — тРНК лейцина, a UGU присоединяет тРНК цистеина. В конце концов с помощью ученых из других лабораторий был расшифрован генетический код всех аминокислот и получен своеобразный «генетический словарь» (табл. 9.1).

На основании приведенной таблицы можно сделать ряд выводов. Как и предсказывал Крик, код оказался вырожденным, но при этом количество кодонов, определяющих ту или иную аминокислоту, варьируется от одного (метионин, триптофан) до шести (лейцин, серии, аргинин). Кроме того, вырожденность кода довольно регулярна. В любом случае весь смысл определяют два первых основания (в направлении 5'→3').

Примечание. Каждый из 64 триплетов либо кодирует одну из aivfti-нокислот (обозначенных трехбуквенными сокращениями), либо означает конец синтеза полипептидной цепи.

В восьми случаях не имеет значения, какое за ними следует третье основание, так как аминокислота определяется и без него. В 12 случаях смысл определяет выбор между пурином (A, G) или пиримидином (U, С).

Триплет AUG, кодирующий метионин, в начале гена почти всегда используется для специальной тРНК, переносящей метионин с блокированной аминогруппой (N-формилметионин). В другие места белка метионин переносит другая тРНК.

^ Колинеарность генов и белков

Гипотезу о колинеарности гена белку можно было подтвердить, показав, что последовательность мутаций гена соответствует изменениям последовательности аминокислот, к которым приводят эти мутации. Для этого необходим ген с известной картой, кодирующий белок, последовательность которого также известна. Чарльз Янофски в этих целях исследовал гены ферментов, синтезирующие триптофан (trp-гены) в Е. coli. Янофски с коллегами использовал ген trpA, кодирующий производство белка А, часть фермента триптофансинтетазы. Исследователи определили полную последовательность из 267 аминокислот в белке А дикого типа и в 10 белках-мутантах по локусу trpA. Каждая мутация заменяла во всем белке только одну аминокислоту. Они составили также карты мутационных участков для 10 мутантов и показали, что последовательность мутационных участков и последовательность заменяемых аминокислот в мутантных белках соответствуют друг другу рис. 9.6. Генетическое расстояние между двумя участками мутаций пропорционально расстоянию между аминокислотами, на которые они воздействуют, так что генетическое расстояние, определяемое в результате рекомбинаций, действительно соответствует физическим расстояниям внутри гена. Обратите внимание на то, что в двух случаях два аллеля, выделяемые на основе рекомбинаций, соответствуют разным заменам одной и той же аминокислоты. Обычный глициновый остаток в позиции 210 у мутанта А23 заменяется на глутамин, а у мутанта А46 — на глутаминовую кислоту. Согласно генетическому коду глицину соответствует кодон GGX (где X обозначает А или G), и у мутанта А23 он заменяется на кодон CGX, а у мутанта А46 — на GAX.

Рис. 9.6. Колинеарность гена и синтезируемого им белка. Последовательность мутационных участков в ДНК идентична последовательности аминокислот белка. В двух случаях соседние мутации определяют разные замены одной и той же аминокислоты

Мутации А78 и А58 также по-разному затрагивают один и тот же кодон. Таким образом, ген состоит из линейной последовательности кодонов, определяющей последовательность аминокислот, и кодирующий элемент каждой аминокислоты может в результате рекомбинаций разделяться на части.

Этот впечатляющий генетический эксперимент был подтвержден другим замечательным экспериментом Джорджа Стейзингера и его коллег. Они получили мутанты фага Т4, производящие мутант-ный фермент лизоцим, и выделили синтезируемые ими белки, определив последовательность аминокислот. Под воздействием профлавина они вызвали мутации этого гена и получили супрессор. Белок двойного мутанта оказался почти дикого типа, за исключением небольшого бессмысленного набора аминокислот, соответствующих бессмысленному набору оснований между двумя мутационными участками. Это было изящное и логичное продолжение работы Крика.

Все описанные генетические опыты помогли ученым разработать модель работы гена. Они проводились независимо от биохимических исследований и вместе с тем подтвердили, что код ДНК транслируется в структуру белка.





оставить комментарий
страница9/16
Дата25.09.2011
Размер4.03 Mb.
ТипКнига, Образовательные материалы
Добавить документ в свой блог или на сайт

страницы: 1   ...   5   6   7   8   9   10   11   12   ...   16
отлично
  2
Ваша оценка:
Разместите кнопку на своём сайте или блоге:
rudocs.exdat.com

Загрузка...
База данных защищена авторским правом ©exdat 2000-2017
При копировании материала укажите ссылку
обратиться к администрации
Анализ
Справочники
Сценарии
Рефераты
Курсовые работы
Авторефераты
Программы
Методички
Документы
Понятия

опубликовать
Загрузка...
Документы

Рейтинг@Mail.ru
наверх