Биотехнология как наука 7 icon

Биотехнология как наука 7


2 чел. помогло.
Смотрите также:
Программа курса «Методология и методика научного исследования» Специальность 080507 «Менеджмент...
Общая биология и микробиология...
Комплекс дисциплины «Молекулярная генетика» образовательных профессиональных программ (опп)...
Конспект лекций по дисциплине «Биотехнология растений» для студентов специальности 050701...
Методические указания к лабораторным работам по дисциплине «Биотехнология растений» для...
Научно-образовательный комплекс по специальности 050701 «Биотехнология» учебно-методический...
Примерная программа наименование дисциплины «Вирусология и биотехнология» Рекомендуется для...
Логика – как наука. История развития логики. Формы человеческого мышления...
«Фундаментальные исследования и биотехнология»...
Литература Бочаров В. А...
Культурология как интегративная наука о культуре...
Тема. «Этнопедагогика как наука об истории, теории и опыте народного воспитания»...



Загрузка...
страницы: 1   2   3   4   5   6
вернуться в начало
скачать
^

Список использованной литературы



Нормативно-правовые документы:

  1. Гражданский кодекс РФ (4 часть): от 18.12.2006 N 230-ФЗ

  2. Европейская Патентная конвенция – «ИНИИЦ Роспатента»2002

  3. Правила составления, подачи и рассмотрения заявки на выдачу патента на изобретение (утверждены  приказом Роспатента  от 06.06.2003 № 82)

  4. Конвенция о биологическом разнообразии (Рио-де-Жанейро, 5 июня 1992г.) The Convention on Biological Diversity

  5. Директива 98/44/EC Европейского Парламента и Совета от 6 июля 1998 г. По правовой охране биотехнологических изобретений (DIRECTIVE 98/44/EC OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 6 July 1998 on the legal protection of biotechnological inventions)

  6. Инструкция по применению ЕПК (глава VI «Биотехнологические изобретения») Implementing Regulations to the Convention on the Grant of European Patents of 5 October 1973 as adopted by decision of the Administrative Council of the European Patent Organization of 7 December 2006

  7. Картахенский протокол по биобезопасности к Конвенции о биологическом разнообразии (Монреаль, 29 января 2000 года)

  8. Международная декларация о генетических данных человека (17.10.2003г.)

  9. Закон РФ «О селекционных достижениях», 1993


Литература:

  1. Н.К.Скрипкина Проблемы зарубежного патентования: -Челябинск, Центр научно-технической информации, 2005 г.

  2. Н. Киреева Перспективы совершенствования правовой охраны изобретений: Журнал «ИС. Промышленная собственность» №11, 2005

  3. В.А. Орешкин патентная охрана биологического (генетического и трансгенного) материала: Дис. Москва, 2004г.

  4. Д.Д. Дорофеев Патентоспособность изобретений в Европейском патентном праве: Дис. … канд. юрид. наук :12.00.03 – М.: РГБ, 2005

  5. А.Г. Рыбинец Мировой рынок биотехнологий: тенденции и проблемы становления, развития и регулирования на современном этапе. Перспективы участия России : Дис. ... канд. экон. наук : 08.00.14 : Москва, 2004 180 c. РГБ ОД, 61:05-8/954

  6. М.А. Серова Правовая охрана биотехнологических изобретений, относящихся к макроорганизмам, в соответствии с европейским, евразийским и российским законодательствами Дис. ... канд. юрид. наук: 12.00.03

  7. Е.А. Данилина, В.А. Куликовский Влияние современных высоких технологий на развитие правовой охраны объектов интеллектуальной собственности ОАО ИНИЦ «Патент», Москва, 2006г.

  8. Е. Уткина, Е. Гаврилова Патентное законодательство РФ и правоприменительная практика в области биотехнологии: Журнал «ИС. Промышленная собственность» №10, 2005

  9. О.Д. Скуратовская Патентование объектов в области биотехнологии: Журнал «Патенты и лицензии» №5, 2005

  10. Г.А. Смирнова, Л.В. Калмыкова Патентование объектов в области биотехнологии: Журнал «Патенты и лицензии» №6, 2005

  11. Г.М. Борискина Патентование объектов в области биотехнологии: Журнал «Патенты и лицензии» №7, 2005

  12. Э. Ю. Жаркова Интеллектуальная собственность и проблемы ее защиты в международных отношениях: курсовая, Воронеж, 2007

  13. Bio4EU study: “Consequences, opportunities and challenges of modern biotechnology for Europe” (April 2007)

Интернет-ресурсы

  1. Материалы сайта Федеральной Службы по Интеллектуальной Собственности, Патентам и Товарным Знакам (РОСПАТЕНТ) http://www.fips.ru/

  2. Материалы сайта Европейской Патентной Организации http://www.epo.org/

  3. Учебник «Биотехнология» http://www.biotechnolog.ru/

  4. Материалы сайта Европейской комиссии http://ec.europa.eu/

  5. Материалы сайта OECD http://www.oecd.org

  6. Биотехнология: обзор рынка в 2004 году. Исследование промышленных рынков « www.abercade.ru»

  7. Интернет-журнал "Коммерческая биотехнология" http://www.cbio.ru/



Глоссарий

ГК РФ – Гражданский Кодекс Российской Федерации

ЕПО – Европейская патентная организация

ЕПК – Европейская патентная Конвенция

Аминокислоты (аминокарбоновые кислоты) — органические соединения, в молекуле которых одновременно содержатся карбоксильные и аминные группы

Анаэробы - анаэробные организмы, анаэробионты, аноксибионты, организмы, способные жить и развиваться при отсутствии свободного кислорода и получающие энергию для жизнедеятельности расщеплением органических и неорганических веществ

Аэробы - аэробные организмы, организмы, обладающие аэробным типом дыхания, т. е. способные жить и развиваться только при наличии свободного кислорода

^ Биологически активные добавки (БАД) - композиции натуральных или идентичных натуральным биологически активных веществ, предназначенных для непосредственного приема с пищей или введения в состав пищевых продуктов с целью обогащения рациона отдельными пищевыми или биологически активными веществами и их комплексами

^ Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), присутствующая в каждом организме и в каждой живой клетке, главным образом в её ядре, нуклеиновая кислота, содержащая в качестве сахара дезоксирибозу, а в качестве азотистых оснований аденин, гуанин, цитозин и тимин

Органеллы - (новолат., единственное число organella, уменьшительное от греч. órganon — орудие, инструмент, орган), части тела одноклеточных организмов — простейших, выполняющие различные функции

Полимеразы, нуклеотидилтрансферазы, ферменты класса трансфераз; катализируют синтез нуклеиновых кислот из нуклеозидтрифосфатов в присутствии ДНК или РНК, играющих роль матрицы

Пробиотик — средства восстанавливающие микробиоценозы

^ Рибонуклеиновые кислоты (РНК), тип нуклеиновых кислот, имеющих универсальное распространение в живой природе; содержат в качестве углеводного компонента рибозу, а в качестве азотистых оснований аденин и гуанин и урацил и цитозин


Приложение 1

^ Анализ практики патентования изобретений, относящихся к макроорганизмам, в соответствии с российским патентным законодательством

Примерами патентоспособных изобретений, относящихся к способам получения растений, основанных на указанных выше подходах, могут служить, например, следующие изобретения.

Патент RU 207 39 70 С1 (опубл. 27.02.1997 г.; заявка 94011370/13; дата подачи 31.03.1994 г.) на «Способ получения гетерозисных гибридов огурца».

Формула изобретения

Способ получения гетерозисных гибридов огурца, включающий скрещивание инбредных линий, отличающийся тем, что скрещивают линии, происходящие из разных эколого-географических зон и различающиеся по типу ветвления.

Патент RU 211 67 24 С1 (опубл. 10.08.1998 г.; заявка 96120832/13; дата подачи 18.10.1996 г.) на «.Способ отбора растений клевера, сходного с высокой семенной продуктивностью».

Формула изобретения

Способ отбора растений клевера, сходного с высокой семенной продуктивностью, включающий отбор индивидуальных форм по фенотипу и учету урожайности семян в соцветиях, отличающийся тем, что растения отбирают по максимальному количеству междоузлий, коррелирующих с количеством цветущих головок на герметивном стебле.

Патент RU 218 39 23 С2 (опубл. 27.06.2002 г.; заявка 2000108838/13; дата подачи 07.04.2000 г.) на «Способ создания элитных семян льна-долгунца».

Формула изобретения

Способ создания элитных семян лъна-долгунца, включающий закладку питомника отбора, отбор исходных (маточных) растений и их оценку по числу коробочек, высоте растений и содержанию волокна в технической части стебля, отличающийся тем, что дополнительно определяют среднюю величину массы семени и выбраковывают те растения, масса семени у которых отклоняется от среднеарифметической на ±10% и более.

Указанные патенты относятся к способам получения растений, которые в соответствии с европейским патентным законодательством были бы признаны «по существу биологическими», как состоящие из природных явлений скрещивания и селекции и включающие классические подходы к выведению новых сортов (оценка существенных признаков, по которым проводится да-тьнейший отбор, выращивание растений, обладающих этими признаками, скрещивание их между собой и т.д.) и потому непатентоспособными. Однако в соответствии с законодательством РФ указанные способы подлежат охране патентом, что представляется нам абсолютно справедливым. Данные способы не имеют никакого отношения к выведению новых сортов и решают задачу получения сельскохозяйственных растений с новыми полезными свойствами. При отсутствии патентной охраны такого рода решения вообще бы не получили никакой охраны как объекты интеллектуальной собственности, что создало бы определенный барьер на пути их создания и коммерческого внедрения.

Один показательный патент, касающийся наиболее перспективного направления современной биотехнологии животных, а именно создания животных - биореакторов, продуцирующих полезные вещества с молоком.

Указанный патент RU 209 54 14 СТ (опубл. 10.11.1997 г.; заявка 5052392/13; дата подачи 30.11.1990 г.) выдан на «Трансген для получения рекомбииантного полипептида в молоке трансгенных коров, способ получения трансгенной коровы (варианты), молоко от трапсгенной коровы, пищевой состав».

В пп.1-19 формулы данного патента охарактеризован трансген, предназначенный для: получения рекомбииантного полипептида в молоке трансгенных коров. Пункты 20-21 формулы изложены следующим образом,

п. 20. Способ получения траисгенной коровы, содержащей рекомбинантный полипептид в продуцируемом ею молоке, включающий интродукцию трапсгена по п.1 в эмбриональную клетку-мишенъ коровы, трансплантацию трапсгепной эмбриональной клетки-мишени или полученного из нее эмбриона корове-реципиенту и идентификацию по меньшей мере одной рожденной телочки, способной продуцировать рекомбинантный полипептид в молоке.

п.21. Способ по п.20, отличающийся тем, что он дополнительно включает стадию оплодотворения эмбриональной клетки-мишени in vitro перед интродукцией трансгена.

Пункт 22 формулы касается более сложного способа получения трансгенной коровы, основанного на предварительной идентификации предимплантационного эмбриона, клетки которого содержат заданный трансген.

Пункт 23 формулы относится к молоку, полученному от трансгенной коровы.

п.23. Молоко от трансгенной коровы, содержащее рекомбинантный полипептид, продуцируемое трансгенной коровой, полученной согласно способу, описанному в пп.20,22.

В зависимых пп.24-32 формулы уточняется природа рекомбинантного полипептида.

Пункты 33-35 формулы являются следующими.

п. 33. Пищевой состав, включающий трансгенное молоко, содержащее рекомбинантный полипептид, продуцируемое трансгенной корой, полученной согласно пп.20,22.

п.34. Пищевой состав по п.33, отличающийся тем, что рекомбинантный полипептид по меньшей мере частично очищен от трансгенпого молока.

п 35. Пищевая смесь по п. 33, отличающаяся тем, что составлена из питательных веществ подходящих для детского питания.

Указанный патент интересен тем, что защищает молоко трансгенной коровы и содержащий его пищевой состав, «минуя» саму корову, как таковую.

В целом, формула построена грамотно и предоставляет адекватную охрану соответствующим изобретениям (ср., например, с патентом ЕР 0 502 976 В1, выданным с формулой изобретения, из которой были исключены первоначальные притязания на молоко трансгенных коров).

Патентование элементов организма человека

В этой области обнаружен один патент РФ, а именно патент RU 221 65 91 С2 (опубл.20.11.2003 г.; заявка 2000132213; дата подачи 30.06.2000 г.) на «Способ получения клонированных эмбрионов человека путем применения способа межвидовой трансплантации ядер».

По существу, заявленный способ основан на получении донорньгх соматических клеток человека (в частности, клеток или фибробластов кожи человека, собранных из пупочного канатика новорожденных), введении ядер из этих клеток в энуклеированные (безъядерные) реципиентные ооциты коровы с последующим получением эмбрионов и культивированием эмбрионов in vitro. С точки зрения европейского патентного законодательства выдача подобного патента вряд ли была возможна, поскольку изобретение подразумевает использование клонированных эмбрионов человека в промышленных и коммерческих целях и создание «химеры» человека и животного (генетический материал человека переносится в ооцит коровы). Правда, п. с) Правила 29 Инструкции к ЕПК не оговаривает, использование каких именно эмбрионов запрещено, а пп. (16) и (38) встутгительной части Директивы 98/44/ЕС и n.3.3b(d) Руководства по экспертизе в ЕПВ не дают определения «химеры», что чрезвычайно важно для принципиальной оценки патентоспособности данного изобретения. На наш взгляд, рассмотренное изобретение не относится к способу клонирования человека (которое запрещено в Российской Федерации указам Президента), поскольку не создает полноценного человеческого существа, а касается искусственного получения эмбриональных тканей, которые в дальнейшем могут использоваться для трансплантации человеку, и преследует исключительно гуманные цели, однако, безусловно, на первый взгляд, не может не вызвать негативной реакции со стороны определенным образом настроенных слоев общества. Таким образом, выдача указанного патента обуславливает необходимость внесения более четких формулировок в патентное законодательство (в том числе и в европейское), связанных с исключением из патентоспособности изобретений по причинам несоответствия их общественным интересам, принципам гуманности и морали.

Приложение 2

^ Примеры запатентованных технических решений в области биотехнологии в соответствии с российским законодательством.





^ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО
ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

(19) SU (11) 1586191 (13) A3

(51) 6 C12N15/21, C12P21/00, C12N1/21




(12)^ ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ СССР

Статус: по данным на 26.12.2008 - может прекратить свое действие



(21)

Заявка: 4627942/13

(22)

Дата подачи заявки: 1988.12.29

(45)

Опубликовано: 1999.10.20

(71)

Заявитель(и): Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов




(72)

Автор(ы): Дебабов В.Г.; Свердлов Е.Д.; Козлов Ю.И.; Машко С.В.; Стронгин А.Я.; Стеркин В.Э.; Юрин В.Л.; Лапидус А.Л.; Лебедева М.И.; Изотова Л.С.; Алексенко А.П.; Скворцова М.А.; Ионов Ю.В.; Царев С.А.; Монастырская Г.С.

(73)

Патентообладатель(и): ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов




(54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PPR-IFN-^ F-2, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА-F ЧЕЛОВЕКА И ШТАММ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ИНТЕРФЕРОНА-^ F ЧЕЛОВЕКА

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pPR-IFN-F-2, обеспечивающая синтез лейкоцитарного интерферона-F2 размером 5689 п.н, содержащая:

EcoRI-BamHI - фрагмент векторной плазмиды pPR 322, размером 5169 п.н.;
BamHI-EcoRI - фрагмент размером 520 п.н. плазмиды pLM-IFN-F-27, модифицированной удалением короткого HindIII-BamHI фрагмента;
ori ColEI-ColEI - репликон;
cIts 857 - ген термочувствительного репрессора - фага лямбда;
гены rex(A,B) фага лямбда;
Ap' - ген устойчивости к ампициллину;
terfd - тандем ро-независимых терминаторов транскрипции фага fd;

РROR - регуляторную область и участки инициации трансляции гена cro фага лямбда;

гибридный оперон, состоящий из цистрона cro'-cat', частично перекрывающийся с геном зрелого лейкоцитарного интерферона-F человека (IFN-F), имеющего дополнительный N-концевой метиониновый кодон;

химически синтезированный олигонуклеотид (ON), обеспечивающий трансляционное сопряжение генов гибридного оперона;

5'-AATTCGAACAGGAGACTTTCTGATGTGT-3'3'<-GTTTGTCCTCTGAAAGACTACACAGATC-5'

2. Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-4567 - продуцент лейкоцитарного интерферона-F человека.








^ ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ

(19) RU (11) 2191388 (13) C1

(51) 7 G01N33/53




(12)^ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Статус: по данным на 26.12.2008 - действует



(21)

Заявка: 2001134051/14

(22)

Дата подачи заявки: 2001.12.18

(24)

Дата начала отсчета срока действия патента: 2001.12.18

(45)

Опубликовано: 2002.10.20

(56)

Список документов, цитированных в отчете о поиске: RU 2137484 С1, 20.09.1999. RU 2170104 C2, 10.07.2001. RU 2126260 C1, 20.02.1999. RU 2160112 C1,10.12.2000.




(71)

Заявитель(и): Закрытое акционерное общество "РЕМЕТЭКС"

(72)

Автор(ы): Репин В.С.; Ржанинова А.А.; Шаменков Д.А.

(73)

Патентообладатель(и): Закрытое акционерное общество "РЕМЕТЭКС"




Адрес для переписки: ^ 109544, Москва, ул. Школьная, 49, 3 этаж, ЗАО "РЕМЕТЭКС"




(54) КУЛЬТУРА НЕРВНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, БИОТРАНСПЛАНТАТ ДЛЯ АЛЛОПЕРЕСАДКИ И СПОСОБ ЕГО ПРИГОТОВЛЕНИЯ

Изобретение относится к области медицины. Изобретение характеризуется тем, что культура стволовых нервных клеток получена из ткани переднего мозга абортивных эмбрионов человека первого триместра беременности или из перивентрикулярной области головного мозга абортивных плодов человека 15-20 недель гестации. Биотрансплантат для аллопересадки включает указанные стволовые клетки, селективно выделенные и размноженные до количеств 107-109 плюрипотентных недифференцированных клеток в составе нейросфер. Для приготовления биотрансплантата ткань головного мозга эмбрионов человека суспендируют, далее культивируют в бессывороточной среде с добавлением ростовых факторов, неоднократно заменяя среду; образующиеся клеточные агрегаты диссоциируют и нейросферы стволовых клеток отделяют. Изобретение обеспечивает повышение эффективности лечения заболеваний и травм ЦНС, устранение побочных эффектов при пересадке биотрансплантатов. 3 с. и 4 з.п.ф-лы.

^ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к области медицины и касается приготовления культуры генетически немодифицированных нервных стволовых клеток человека для использования в качестве биотрансплантата в реконструктивной нейрохирургии.

Лечение заболеваний и травм центральной нервной системы до настоящего времени является одной из сложнейших задач, стоящих перед медициной. Это обусловлено не только их частотой, но и тяжелыми последствиями: психоневрологическими расстройствами, большим процентом инвалидизации, смертностью. Несмотря на расширение арсенала диагностических возможностей, позволивших углубить представление об этиологии и патогенезе патологических процессов, традиционные методы лечения не всегда позволяют достичь желаемого результата.

Поскольку в основе психических и неврологических нарушений при органическом поражении головного мозга лежит поражение морфологических структур последнего, перспективным представляется использование для лечения этой категории больных оперативного вмешательства с пересадкой стволовых нервных клеток, способных мигрировать в очаг поражения и направленно дифференцироваться в нейроны, астро- и олигодендроглию. Основой для проведения таких операций является иммунологическая привилегированность головного мозга, благодаря которой пересаженный эмбриональный аллотрансплантат не отторгается.

Наибольшее распространение в настоящее время получили пересадки кусочков эмбрионального мозга или суспензии диссоциированной мозговой ткани абортного плода. Однако эти методы имеют следующий ряд недостатков.

Эмбриональный мозг, кроме стволовых клеток, способных при аллопересадке направленно дифференцироваться во все типы нервных клеток, содержит уже дифференцированные клетки, которые являются узко специализированными и не обладают миграционными способностями. Дифференциация клеток фетального мозга начинается на ранних этапах и продолжается в течение всего периода внутриутробного развития. У плодов 17-21 недель гестации, которые использует для получения клеточного трансплантата Г.Т. Сухих (Патент RU 2160112) доля клеток зрелого нейронального фенотипа составляет более 80%. Трансплантат, в основном состоящий из зрелых клеток, оказывает выраженное трофическое действие, активируя оставшиеся неповрежденными отделы мозга, однако в организме реципиента не развивается и в результате погибает. Кроме того, первичная суспензия фетального мозга всегда включает примесь клеток, экспрессирующих антигены гистосовместимости II класса (микроглия, фрагменты кровеносных сосудов, кровяные форменные элементы). Присутствие данного клеточного балласта в трансплантате вызывает нежелательные побочные эффекты (головные боли, фебрилитет, менингеальные симптомы), которые в значительной мере осложняют течение послеоперационного периода.

Применение в качестве трансплантата культуры стволовых клеток позволяет повысить эффективность лечения и избежать нежелательных эффектов.

Линии гомогенных плюрипотентных стволовых клеток человека, полученные в результате клонирования трансформированных клеток эмбрионального мозга (Snyder E. et al., United States Patent 5958767) при нейротрансплантации с высокой эффективностью мигрируют, встраиваются в очаг поражения и развиваются в нейроны, астроциты и олигодендроциты. Однако иммортализованные клеточные линии, являясь идеальным инструментом для научных экспериментов на лабораторных животных, едва ли смогут найти применение в медицине.

Технической задачей настоящего изобретения является повышение эффективности лечения органических поражений и травм центральной нервной системы, устранение побочных эффектов при пересадке клеточных биотрансплантатов.

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.

Предложена культура генетически немодифицированных нервных стволовых клеток, полученная из ткани переднего мозга эмбрионов человека 1-ого триместра беременности, или перивентрикулярной области головного мозга плодов 15-20 недель гестации.

Кроме того, предложен биотрансплантат, включающий указанную культуру стволовых клеток, селективно размноженных в условиях культивирования до количества 107-109 плюрипотентных недифференцированных клеток в составе нейросфер.

Кроме того, предложен способ приготовления биотрансплантата для аллопересадки, характеризующийся тем, что ткань переднего мозга эмбрионов человека 1-ого триместра беременности или из перивентрикулярной области головного мозга плодов человека 15-20 недель гестации с исходной жизнеспособностью клеток не менее 60% и содержанием клеток, экспрессирующих маркер стволовых клеток нестин не менее 15-20%, суспендируют, далее клетки культивируют в бессывороточной среде с добавлением ростовых факторов, неоднократно заменяя среду, образующиеся клеточные агрегаты диссоциируют и нейросферы отделяют. При этом клетки культивируют в течение 12-16 дней на чашках Петри при 37oС в атмосфере 5% СО2. Культивирование проводят на среде DMEM/F12 (1: 1)+N2 (Gibco BRL, USA) в присутствии ростовых факторов bFGF и/или EGF и включает 4 пассажа. Клетки выращивают при плотности 2 млн в мл. Замену среды осуществляют каждые 4 дня.

Для приготовления биотрансплантата используют фетальный абортивный материал, полученный при искусственном прерывании беременности у здоровых, предварительно обследованных на наличие вирусных и трансфузионных инфекций женщин. В целях сохранения целостности эмбриона аборт производят вакуумэкстракцией (на сроках до 12 недель) и методом трансабдоминального амниоцентеза в случаях позднего прерывания (15-20 недель). Фетальный материал переносят в стерильный сосуд с раствором Хэнкса и гентамицина (80 мг/л). Дальнейшая работа проводится в стерильных условиях ламинарного бокса. Мозговую ткань измельчают многократным пипетированием до получения одноклеточной суспензии.

Биоматериал для культивирования отбирают с жизнеспособностью клеток не менее 60% в стандартном тесте с трипановым синим. В реальной практике получить препараты абортного мозга с исходной очень высокой жизнеспособностью (более 90%), необходимой для успешного культивирования, удается крайне редко.

Метод отделения живых клеток 3-4-кратным низкоскоростным центрифугированием позволяет увеличить долю живых клеток и довести жизнеспособность материала для культивирования до 90-95%. В образцах суспензий, соответствующих требованиям по жизнеспособности, определяют долю клеток, экспрессирующих маркер стволовых клеток нестин. Кондиционными считаются культуры, в которых нестинположительных клеток не менее 15-20%.

Культивирование НСК производится в течение 12-16 дней и включает проведение 4-х пассажей. Подобранные нами экспериментально условия, объединяющие критерии отбора исходного биоматериала и режим (длительность) культивирования, являются оптимальными для достижения следующих результатов:

- Концентрация нестин-экспрессирующих клеток возрастает в 3-5 раз, что в конечной культуре составляет в среднем более 80%. Таким образом, культура НСК после четырехкратного пассирования представляет собой суспензию клонов НСК (нейросфер) с незначительной примесью одиночных клеток, легко удаляемых после кратковременного центрифугирования

- Выбранная нами продолжительность культивирования в условиях бессывороточной среды достаточна для практически полной гибели балластных клеточных элементов: дифференцированных нервных клеток, а также примесных иммунокомпетентных клеток (микроглия, кровяные элементы), которые всегда присутствуют в первичной суспензии диссоциированной мозговой ткани.

- Проведение четырехкратного пассирования культур нервных эмбриональных клеток в селективной среде позволяет получить "урожай" нейросфер НСК, которые, с одной стороны, обладают признаками стволовых клеток (мультипотентность, клональный рост, способность к пролиферации in vitro) и, с другой стороны, представляют собой гетерогенную клеточную популяцию, что увеличивает терапевтические возможности при трансплантации.

Культивирование НСК проводят по следующей методике.

Суспензию первичных диссоциированных нейральных клеток, полученных из эмбрионального мозга, культивируют на непокрытых носителями культуральных чашках Петри в бессывороточной среде, содержащей ростовую среду DMEM/F12 (1: 1, Gibco BRL) + N2 (Gibco BRL) с добавлением ростовых факторов bFGF (10-20 мкг/мл, Sigma) и /или EGF (10-20 мкг/мл, Sigma). Замену среды производят через каждые 4 дня. Образующиеся клеточные агрегаты ежедневно диссоциируют пипетированием. Нейросферы, состоящие из стволовых клеток, отделяют кратковременным центрифугированием.

В качестве биотрансплантата используют свежеполученную клеточную культуру или после криоконсервации. В качестве криопротектора используют 7% диметилсульфоксид (DMSO).

Патентуемая технология может использоваться для лечения наследственных заболевания ЦНС у детей, травм головного и спинного мозга, демиелинизирующих заболеваний, травм и нейродегенеративных заболеваний сетчатки глаза, возрастных нейродегенеративных и нейромышечных заболеваний.

Конкретный пример использования биотрансплантата.

Больной А., 8 лет. В результате автотравмы произошел вдавленный перелом левой теменной кости; ушиб-сдавление головного мозга; субдуральная гидрома справа (60 мл); субдуральная гематома слева (30 мл). В 20 ГБ проведена экстренная операция: слева резекционная трепанация черепа, удаление гематомы; справа фрезотомия, удаление гидромы.

4 дня после травмы - кома I степени, ИВЛ, тонические судороги, расходящееся косоглазие, фиксация взора вправо, анизокория d>s, левосторонний гемипарез, трофические нарушения (пролежни), зондовое кормление. Глазное дно - нечеткие границы ДЗМ - справа.

11 дней после травмы - кома I степени, ИВЛ, неврологический статус с небольшой положительной динамикой, регресс судорог, расходящееся косоглазие, отризм, анизокория. НСГ - сохранение отека головного мозга.

15 дней после травмы - тонические судороги, кома I степени.

18 дней после травмы - компьютерная томография: симметричная гидроцефалия, эпидуральная гематома теменной области слева.

20 дней после травмы - сопор, кратковременная фиксация взора, желудочный зонд удален; самостоятельно глотает; гемипарез левосторонний с контрактурой в локтевом суставе, тугоподвижность в голеностопных s>d; гиперхинизм; трофические нарушения.

В течение 1 месяца очень медленная динамика в установлении сознания, выраженные пирамидные и экстрапирамидные нарушения, к концу 2 месяца после травмы появилось понимание обращенной речи, выполнение отдельных инструкций без активной речевой продукции, негативное отношение к осмотру, двигательная активность в пределах кровати - не садится, не встает, опоры нет. На ЭЭГ - грубые общемозговые нарушения в виде дизритмии среднего вольтажа, отсутствие основного ритма, преобладание медленной активности 5-6 Гц амплитудой 50-100 мкВ, более четко при спектральном анализе. Периодически генерализованные разряды 4-5 Гц 200 мкВ с глубинных структур s>d.

Проведена вентрикулярная пункция с введением биотрансплантата нервных стволовых клеток (100 млн клеток в объеме 4 мл).

К концу недели после пересадки клеток значительная динамика в восстановлении психической активности, речевой продукции: стал говорить предложениями с живой эмоциональной окраской; стал читать, осмысленно улыбается, считает с переходом через 10. Передвигается при поддержке.

На ЭЭГ - отчетливая положительная динамика: основной ритм 8-9 Гц 50-100 мкВ в теменно-затылочных отведениях с адекватной реакцией на афферентные раздражители. Пароксизмальная активность глубинного генеза.

Таким образом, в течение 2 недель после подсадки наблюдали положительную динамику в восстановлении интеллектуальной, речевой, двигательной активности. Восстановление биоэлектрической активности мозга по ЭЭГ, близкой к возрастной норме.

^ ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


1. Культура генетически немодифицированных стволовых нервных клеток, полученная из ткани переднего мозга эмбрионов человека 1-го триместра беременности или перивентрикулярной области головного мозга плодов человека 15-20 недель гестации.

2. Биотрансплантат для аллопересадки, характеризующийся тем, что он включает нервные стволовые клетки, полученные из ткани переднего мозга эмбрионов человека 1-го триместра беременности или перивентрикулярной области головного мозга плодов человека 15-20 недель гестации, выделенные и селективно размноженные до количества 107-109 плюрипотентных недифференцированных клеток в составе нейросфер.

3. Способ приготовления биотрансплантата для аллопересадки, характеризующийся тем, что ткань переднего мозга эмбрионов человека 1-го триместра беременности или перивентрикулярной области головного мозга плодов человека 15-20 недель гестации, с исходной жизнеспособностью клеток не менее 60% и содержанием клеток, экспрессирующих маркер стволовых клеток нестин не менее 15-20%, суспендируют, далее клетки культивируют в бессывороточной среде с добавлением ростовых факторов, неоднократно заменяя среду, образующиеся клеточные агрегаты диссоциируют и нейросферы отделяют.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что клетки культурируют в течение 12-16 дней на чашках Петри при 37oС в атмосфере 5% СО2.

5. Способ по п.3 или 4, отличающийся тем, что культивирование проводят на среде DMEM/F 12(1:1)+N2 (Gibco BRL, USA) в присутствии ростовых факторов bFGF и/или EDF и включает 4 пассажа.

6. Способ по любому из пп.3-5, отличающийся тем, что клетки выращивают при плотности 2 млн в мл.

7. Способ по любому из пп.3-6, отличающийся тем, что замену среды осуществляют каждые 4 дня.

Приложение 3




оставить комментарий
страница5/6
Дата21.09.2011
Размер1,14 Mb.
ТипДокументы, Образовательные материалы
Добавить документ в свой блог или на сайт

страницы: 1   2   3   4   5   6
не очень плохо
  1
отлично
  3
Ваша оценка:
Разместите кнопку на своём сайте или блоге:
rudocs.exdat.com

Загрузка...
База данных защищена авторским правом ©exdat 2000-2017
При копировании материала укажите ссылку
обратиться к администрации
Анализ
Справочники
Сценарии
Рефераты
Курсовые работы
Авторефераты
Программы
Методички
Документы
Понятия

опубликовать
Загрузка...
Документы

наверх